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Wechselwirkung von normoxischen und anoxischen Kardiomyozyten mit polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten

Szalay, Zoltán


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für Physiologische und Klinische Forschung, Kerckhoff-Institut, Abt. Experimentelle Kardiologie, Bad Nauheim
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.1999
Erstellungsjahr: 1997
Publikationsdatum: 17.11.1999
Kurzfassung auf Englisch: The pathophysiological significance of free radicals after reperfusion of ischemic myocardium is still debated. Therefore, experiments were carried out with adult
isolated cardiac myocytes in direct contact with stimulated neutrophils (ratio of neutrophils/myocytes: 10/1). Rat cardiac myocytes were isolated by
Langendorff - perfusion with collagenase. Three different groups of myocytes were investigated: normoxic, 2h and 12h in anoxic conditions. Neutrophils were
isolated from rat blood by Percoll-gradient-centrifugation. The neutrophils were stimulated with N-formyl Met-Leu-Phe (fMLP), phorbolmyrestatacetate
(PMA) and zymosan (Z). The formation of oxygen free radicals was detected as a bioluminescence signal mediated by luminol. The kinetics of the free radical
burst (FRB) resulted in an early maximum for fMLP stimulated neutrophils (20 sec) and for maxima at 5 min (PMA) and 20 min (Z). The FRB was depressed
in the presence of normoxic myocytes compraed to controls (neutrophils alone) by 45% (fMLP stimulation), 30% (PMA) and 22% (Z). In contrast the signal
increases in the presence of 2h anoxic myocytes by 12% (fMLP), 81% (PMA) and 6% (Z). In the presence of 12h anoxic myocytes the FRB increases further
to 918% (fMLP), 576% (PMA) and 198% (Z) compared to controls. Normoxic myocytes are not attacked by activated neutrophils, while the FRB increases
in presence of anoxic myocytes proportional to their ischemic insult. In conclusion, free radicals may be harmful after reoxygenation only to already severely
damaged myocardial cells.
Kurzfassung auf Deutsch: Rattenmyozyten werden durch Perfusion mit Kollagenaselösung im
Langendorffmodell isoliert. Die Myozyten werden 2h bzw. 12h anoxisch inkubiert.
Eine 90% reine PMN-Fraktion wird aus Rattenblut durch Leukozytenauftrennung im
Dichtegradienten gewonnen. Durch unterschiedliche Stimuli wird der „oxidative
burst‘‘ der PMN erzeugt und die freie Radikalbildung im Auto-Lumat LB 953 als
Biolumineszenzsignal detektiert. PMN werden durch N-formyl Met-Leu-Phe (fMLP)
mit seinem Maximum der freien Radikalbildung in den ersten 20 Sekunden, Phorbolmyristatazetat (PMA) und Zymosan (Zym) mit ihren Maxima bei 5 bzw.
20 Minuten aktiviert. Der „respiratory burst“ der stimulierten polymorphkernigen
Neutrophilen ist in Anwesenheit von normoxischen Myozyten abgeschwächt. Das
Signal erhöht sich in Anwesenheit von 2h bzw. 12h anoxischen Myozyten im Vergleich
zu normoxischen deutlich bzw. massiv. Normoxische Herzmuskelzellen werden nicht
durch gebildete Sauerstoffradikale aktivierter PMN attackiert und überstehen die Co-
Inkubation in der Zellkultur entsprechend gut, während bei anoxischen
Kardiomyozyten die freie Radikalbildung mit der Anoxiedauer korreliert. Die
Überlebenszeit der anoxischen Kardiomyozyten in der Co-Kultur mit aktivierten
PMN nimmt abhängig von der Anoxiedauer der Myozyten drastisch ab. Mit einem
SOD-Inhibitor vorbehandelte normoxische Myozyten verlieren ihre Fähigkeit die
Radikale abzupuffern und sterben viel eher in der Co-Kultur ab im Vergleich zu
normoxischen Myozyten ohne Präinkubation. Damit nähern sie sich in ihrem
Verhalten während der Radikalmessung von aktivierten PMN dem der anoxischen
Myozyten an, wobei sie aber nicht ganz die Sauerstoffradikalbildung der anoxischen
Myozyten erreichen. Neben dem SOD-System der Myozyten spielen aber
wahrscheinlich Oberflächenveränderungen während der Anoxie eine zusätzliche
Rolle.

Durch Neuraminidase vorbehandelte Myozyten erzeugen einen Anstieg der
Radikalproduktion und damit einen gesteigerten „respiratory burst‘‘ der aktivierten
PMN. Die aus den Experimenten gewonnenen Messergebnisse des
Biolumineszenzassays und die Beobachtungen aus der Zellkultur weisen daraufhin,
daß einerseits das endogene Radikalfängersystem der Myozyten Schaden nimmt, so
daß die gebildeten Radikale nicht mehr eliminiert werden können, bevor sie
Zellschäden verursachen können, und andererseits auch die veränderten
Oberflächenstrukturen der Myozyten die aktivierten PMN zu einer höheren
Radikalproduktion anregen. Beide Komponenten bewirken dann unter anderem die
kurze Überlebenszeit der anoxischen Myozyten im Kontakt mit aktivierten PMN.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß bei der Reperfusion und Reoxygenierung des
Myokards, mit dem Blut PMN eingeschwemmt werden, welche nach Aktivierung im
Gewebe die reversibel geschädigten, ischämischen Myozyten durch die Produktion
von freien Sauerstoffradikalen schädigen können.