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Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten Lebensmitteln mittels HPLC und GC

Baek, In-Girl


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Ernährungswissenschaft, Professur für Lebensmittelwissenschaften
Fachgebiet: Haushalts- und Ernährungswissenschaften - Ökotrophologie
DDC-Sachgruppe: Haushaltswissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.07.1999
Erstellungsjahr: 1999
Publikationsdatum: 29.07.1999
Kurzfassung auf Deutsch: Aminosäuren stellen die monomeren Bausteine der für lebende Organismen wichtigsten Stoffklassen, der Peptide und Proteine, dar. Besondere Bedeutung
haben [Alpha]-Aminosäuren, bei denen Amino- und Carboxylgruppe gemeinsam am C-2 gebunden sind. Beim Abbau von Proteinen werden regelmäßig 20
verschiedene [Alpha]-AS gefunden, die dementsprechend als proteinogene AS bezeichnet werden. Proteinogene Aminosäuren (AS), mit Ausnahme des
Glycins, besitzen zumindest ein Chiralitätszentrum, welches durch ein asymmetrisch substituiertes C-Atom gebildet wird, so daß zu jeder dieser AS ein
zueinander spiegelbildlicher Enantiomer existiert.

Im Verlauf der Evolution hat sich in der Biosphäre eine starke Dominanz der Synthe-se und Verwendung von L-Aminosäuren (L-AS) gegenüber von
D-Aminosäuren (D-AS)herausgebildet. Trotz der weitgehenden Etablierung stereoselektiver Prozesse in der belebten Natur zeigt sich innerhalb der
proteinogenen AS eine beachtenswerte Verbreitung der D-AS. Die Entwicklung und Anwendung neuer Analysenmethoden zur Trennung von D- und L-AS
zeigt jedoch, daß D-AS im Menschen, in Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen (MO) und Antibiotika, sowie in Lebensmitteln häufiger vorkommen als bislang
angenommen wurde.


Von Bakterien ist schon seit längerer Zeit bekannt, daß sie einen ausgeprägten D-AS-Stoffwechsel besitzen, der sie zur Biosynthese der D-AS aus den L-AS
durch entsprechende Racemasen und Epimerasen befähigt. D-AS sind in fermentierten LM durch zur Herstellung eingesetzten MO weit verbreitet. Durch das
Einwirken mikrobieller Enzyme werden L-AS teilweise in ihre optischen Antipoden umgewandelt. Zusätzlich werden durch Autolyse von Bakterien D-AS aus
deren Peptidoglycan freigesetzt, so daß D-AS als mikrobielle Stoffwechselprodukte in diesen Lebensmitteln (LM) in relativ hohen Mengen auftreten. Viele
protein- und aminosäurehaltige LM werden bei ihrer Herstellung, technologischen Bearbeitung oder Zubereitung einer Behandlung mit Säuren, Laugen und
Hitze unterzogen, was zu einer mehr oder weniger starken Epimerisierung führt, die durch Gegenwart von Metallionen zusätzlich katalysiert werden kann.


Aus diesem Grunde wurde von BRÜCKNER et al. vorgeschlagen, daß D-AS als Indikatoren für die mikrobielle Fermentation und weiterhin zur Qualitäts- und
Authentizitätskontrolle für fermentierten LM verwendet werden können. Biogene Amine (BA), stickstoffhaltige, basische Verbindungen, entstehen im
Stoffwechsel von Tieren, Pflanzen oder MO. Da ihre Bildung in LM größtenteils aus AS durch Aktivität der Decarboxylasen in MO erfolgt, sind besonders
hohe Amingehalte in LM zu erwarten, bei deren Herstellung bzw. Verarbeitung oder Lagerung biochemische oder besonders mikrobiologische
Eiweißveränderungnen wie Fermentation oder Verderb stattfinden. Insbesondere in LM, die einer mikrobiellen Fermentation unterzogen wurden oder
mikrobiell verdorben sind, können höhere Konzentrationen an BA gefunden werden. Aus diesem Grunde wird die Menge an Aminen zur Beurteilung der
mikrobiellen Belastung von LM vorgeschlagen. In der vorliegenden Arbeit wurden Aminosäuren und biogene Amine in asiatisch fermentierten Lebensmitteln
(engl. „Oriental or Asian Fermented Food“) exemplarisch anhand einer Gruppe fermentierter Sojaprodukte u. a. Sojasaucen, Miso und Pepperonipasten,
sowie Sake und Fischsaucen mittels HPLC und teilweise GC unter-sucht, um neue Perspektiven zur Qualitäts- und Authentizitätskontrolle für die untersuchten
Lebensmitteln zu ermitteln.


Zur achiralen AS-Analyse wurde eine HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd/3-Mercaptopropionsäure (OPA/MPA) mit
Kombination von 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (FMOC-Cl) verwendet. Die Gesamtgehalte an freien AS in fermentierten Sojasaucen lagen zwischen
15 g/l und 57 g/l sowie zwischen 75 g/l und 396 g/l in gemischten Sojasaucen. Besonders auffällig war bei dieser Untersuchung die Detektion der
nichtproteinogenen AS Cit und Orn, welche in Rohmaterialien (Sojabohnen) nicht vorhanden und durch Umwandlung von Arg während der Fermentation
entstanden waren. Alle fermentierten Sojasaucen zeigten eine positive Korrelation zwischen der Reifungsdauer und dem relativen Anteil von Orn. Somit können
diese beiden nichtproteinogenen AS als Indikatoren zur Qualität- und Authentizitätskontrolle für Sojasaucen verwendet werden.
Aufgrund der Ähnlichkeit des Herstellungsverfahrens wiesen alle untersuchten Miso- und Pepperonipastenproben ein den fermentierten Sojasaucen ähnlichen
AS-Muster auf. Orn wurde in allen, Cit in den meisten der untersuchten Misoproben detektiert. Sojabohnenmiso wiesen aufgrund der langen Reifungsdauer
einen hohen Anteil von Orn und Cit im Vergleich zu Weizenmiso auf. Bei dieser Untersuchung wurde festgestellt, daß das Verhältnis zwischen den Anteilen von
Arg und Orn als ein Kriterium für die Bestimmung der Fermentationsdauer dienen könnten.


Zur Trennung und Bestimmung von freien D-AS wurde eine chirale HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd und N-Isobutyryl-L
(bzw. D)-cystein (OPA/IBL(D)C) verwendet. Außerdem wurde die Anwendbarkeit der OPA/IBL(D)C-Methode für verschiedene HPLC-Apparaturen zur
enantioselektiven Aminosäurenanalytik am Beispiel von LaChrom® - und HP 1090-System überprüft. In allen untersuchten fermentierten Sojaprodukten
wurden erhebliche Mengen an D-AS gefunden. Dabei wurde festgestellt, daß besonders D-Asp und D-Ala als Marker für Fermentation dienen könnten. In
fermentierten Sojasaucen war D-Ala aufgrund der Aktivität der mikrobiellen Ala-Racemase dominierend. In gemischten Sojasaucen war D-Asp aufgrund der
Säurehydrolysierung der Rohmaterialien Major-D-AS. Im Falle der Misountersuchung konnte D-Ala für die Bestimmung der Fermentationsdauer festgestellt
werden. Aufgrund der unterschiedlichen Reifungsdauer war D-Ala in Reispepperonipasten sowie D-Asp in Weizenpepperonipasten dominierend. Sake und
Fischsaucen wiesen eine hohe Gehalte an D-Asp, D-Glu, D-Ser, D-Pro und D-Ala auf.


Biogene Amine wurden als Ergänzung zur Qualitätskontrolle für fermentierte Lebensmittel unter Einsatz einer HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung
mit para-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid (PNZ-Cl) analysiert. Die Gesamtgehalte an BA lagen zwischen 79 mg/l und 1215 mg/l in Sojasaucen sowie zwischen
75 mg/kg und 1085 mg/kg in Miso. Pepperonipasten wiesen bedingt durch den verlangsamten Fermentationsverlauf einen niedrigen BA-Gehalt auf. In Sake
konnten Pea und Oct in allen sowie Spd und Spm in einer Probe detektiert werden.
Die OPA/IBL(D)C-Methode ermöglicht die Trennung aller proteinogenen L-AS und der entsprechenden D-Enantiomere (17 DL-AS Paare), Glycin, Gaba,
DL-Cit, DL-Orn sowie des internen Standards L-Abu mit Ausnahme von Prolin und Cyst(e)in mittels System HP 1090 an einer konventioneller RP-18-Phase
(Hypersil®ODS2) unter Verwendung eines einfachen linearen Gradienten innerhalb von 75 min in einem chromatographischen Lauf. Der Wechsel von IBLC
auf IBDC führt dabei zu einer Elutionsumkehr innerhalb der Enantiomerenpaare, bei Derivatisierung mit IBLC eluieren zuerst die L-AS, bei IBDC die D-AS.
Die Reihenfolge der AS untereinander bleibt jedoch unverändert, was vorteilhaft für die Identifizierung und Absicherung der Zuordnung der detektierten Signale
ist. Die Gesamttrennung und die Elutionsfolge der AS waren beim LaChrom®System und beim HP 1090 System nahezu identisch, wobei einige
Überschneidungen bzw. Koelutionen einzelner AS beobachtet wurden.