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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-1015
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/1999/101/


Langzeitkultur primärer Lutealzellen des bovinen Corpus luteum in einem kontinuierlichen Bioreaktor und Untersuchung der Progesteronproduktion in vitro

Giese, Christoph


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie und Endokrinologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.11.1999
Erstellungsjahr: 1999
Publikationsdatum: 15.12.1999
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Langzeitkultur endokrin aktiver Primärzellen aus dem bovinen Corpus luteum etabliert. Dafür wurde ein
kontinuierlicher Bioreaktor in modularer Bauweise entwickelt, in dem Lutealzellen auf Hohlfasern oder trägergebunden im Wirbelschichtverfahren kultiviert
werden konnten. In klassischer Kultur sowie im Bioreaktor konnte die Progesteronproduktion der Lutealzellen über einen Zeitraum bis zu 119 Tagen
untersucht und nachgewiesen werden.


Aufbauend auf den in der Literatur beschriebenen Verfahren zur Präparation und Kultur von primären Ovarial- und Lutealzellen sowie Leberzellen
verschiedener Säugetiere wurden Methoden entwickelt, die es ermöglichten, Lutealzellen des Rindes in Kultur zu nehmen, sie über einen Zeitraum von
mehreren Monaten zu kultivieren und ihre Progesteronproduktion in vitro nachzuweisen. Die Progesteronproduktion diente als Maß der Funktionsfähigkeit und
damit der Vitalität der Lutealzellen. Durch Variation der verwendeten Kulturmedien und Mediensupplemente wurde die Kultur hinsichtlich der Produktionsrate
an Progesteron optimiert. Durch Zugabe des luteotropen Hormons hCG ließ sich die Progesteronsynthese stimulieren.


Es wurde ein kontinuierlich betriebender Bioreaktor entwickelt und auf die Erfordernisse der Kultur von Lutealzellen abgestimmt. Seine modulare Konzeption
ermöglichte den wahlweisen Einsatz verschiedener Kulturverfahren, wie Hohlfaser-, Wirbelschicht- oder Festbettkultur. Der Bioreaktor umfaßt neben den
Kulturmodulen ein Perfusionssystem zur Versorgung mit Sauerstoff und Kohlendioxid. Über den kontinuierlichen Austausch des Kulturmediums ist eine
optimale Versorgung mit Substraten sowie Entsorgung von Produkten und potentiell inhibitorisch oder toxisch wirkenden Metaboliten gewährleistet. Eine
PC-gestützte Prozeßkontrolle ermöglichte die Aufnahme von Meßwerten über Sensoren, die Chemostatisierung der Kultur über Regelalgorithmen und die
Protokollierung der Prozeßdaten.


Primäre Lutealzellen konnten im modularen kontinuierlichen Bioreaktor im Hohlfaser- sowie im Wirbelschichtbetrieb bis zu drei Wochen erfolgreich kultiviert
und die Produktion von Progesteron über die gesamte Kulturdauer nachgewiesen werden. Durch Zugabe von Prostaglandin F2a, einem beim Rind luteolytisch
wirkenden Gewebshormon, war es möglich, die Progesteronproduktion definiert zu inhibieren.
Kurzfassung auf Englisch: This thesis presents long-term culture of primary bovine luteal cells using conventional cell-culture techniques and bioreactors. Aimed at the evaluation of bovine
luteal cell characteristics a continuous bioreactor in modular conception was developed using commercial hollow-fiber modules as well as a self-designed
fluidized-bed module for suspended microcarriers. Progesterone production of luteal cells was successfully assayed for about 119 days in vitro.

At first, long-term culture and characterization of primary bovine luteal cells is described. Preparation and cultivation are based on common protocols for
ovarian cells, luteal cells and hepatocytes of different mammalians. Progesterone production rate is used to describe cell vitality and luteal function in-vitro. The
production of progesterone is optimized by varying culture conditions, cell-culture media and medium-supplements and was stimulated under gonadotropine
hCG treatment.

The bioreactor was developed in a modular concept for the use of different culture methods. Hollow-fiber and tank-reactor modules, using fluidized-bed
techniques with suspended microcarriers or fixed-bed techniques with porous macrocarriers provided ideal conditions for growth of adherent cells. Optimum
oxygen and carbondioxide uptake are provided by a regulated perfusion-system enabling distinct oxygen concentration and pH-value. The continuous
medium-exchange provides defined and optimized supply of substrates and removal of products, inhibitors or toxic factors. The online acquisition of sensor
data, the chemostat controlling and the storage of process data was realized by a PC-based process control.

Primary luteal cells were cultured in a continuous bioreactor using hollow-fiber and fluidized-bed modules and progesterone production was assayed for about
21 days. Using the luteolytic factor prostaglandin F2a, defined inhibition of progesterone production could be demonstrated.