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Persistence of H4N6, H5N1, and H6N8 avian influenza viruses, H1N1 human influenza virus, and two model viruses (NDV and ECBO) in various types of water, lake sediment, duck feces, and meat

Nazir, Jawad


Originalveröffentlichung: (2011) Giessen : VVB Laufersweiler
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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-81220
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8122/


Universität Justus-Liebig-UniversitĂ€t Gießen
Institut: Institut fĂŒr Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: VeterinÀrmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5742-8
Sprache: Englisch
Tag der mĂŒndlichen PrĂŒfung: 17.04.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 12.05.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Untersuchung wurde durchgefĂŒhrt, um die Persistenz von AIV in einer Vielfalt von kontaminierten Medien und Substraten unter unterschiedlichen Umweltbedingungen zu untersuchen. Wildwasservögel dienen als Reservoir fĂŒr Influenza-A-Viren. Infizierte Vögel scheiden eine hohe Anzahl an Viren ĂŒber die nasale Sekretion und den Kot aus. Dies fĂŒhrt zu einer erheblichen Kontamination der Umwelt. Um die TenazitĂ€t dieser Viren unter natĂŒrlichen Bedingungen zu bestimmen, wurde die Persistenz von drei LPAI-Viren (H4N6, H5N1, H6N8), eines humanen Influenza-Viruses (H1N1) und von zwei Modellviren (NDV und ECBO) in unterschiedlichen Wasserarten (destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung und OberflĂ€chenwasser), in Seesediment, Entenkot und Entenfleisch bei 10 °C, 0 °C, 10 °C, 20 °C und 30 °C ĂŒber eine lange Zeitdauer bestimmt.
Das NDV und die Influenzaviren wurden im Allantoissack von 9-11 Tage alten SPF-HĂŒhnerembryonen vermehrt, wĂ€hrend das ECBO-Virus in MDBK-Zellkulturen vermehrt wurde. FĂŒr die TenazitĂ€tsuntersuchungen in Wasser wurden das destillierte Wasser und die physiologische Kochsalzlösung autoklaviert, wĂ€hrend das OberflĂ€chenwasser, das aus dem Bodensee entnommen wurde, ohne Behandlung verwendet wurde. Die Virusquantifizierung wurde zu Beginn der Versuche und dann anschließend in regelmĂ€ĂŸigen ZeitabstĂ€nden mit der EndpunktverdĂŒnnungsmethode auf MDCK-Zellen fĂŒr Influenzaviren, auf Vero-Zellen fĂŒr NDV und auf MDBK-Zellen fĂŒr ECBO-Virus durchgefĂŒhrt. Die Virustiter wurden als TCID50/ml mit der Spearman-KĂ€rber-Formel errechnet. Aus allen Behandlungsgruppen wurden jedes Mal Doppelproben ĂŒber die Dauer von maximal 36 Wochen untersucht. Die Daten, die der Reihe nach erhalten wurden, wurden mit einem linearen Regressionsmodell analysiert, um die D-90-Werte (benötigte Zeit fĂŒr die Reduktion der Viruskonzentration um eine Log10-Stufe) zu berechnen und damit die geschĂ€tzte Persistenz der VirusinfektiositĂ€t bei einer Virusstartkonzentration von 106,00 TCID50/ml.
Die InfektiositĂ€t der Influenzaviren blieb am lĂ€ngsten in destilliertem Wasser erhalten, gefolgt von physiologischer Kochsalzlösung und OberflĂ€chenwasser. Die einzelnen Influenzaviren waren bei allen Versuchsbedingungen in ihrer SensitivitĂ€t gegenĂŒber der Inaktivierung nicht einheitlich. Die D-90-Werte der Influenzaviren in beimpftem destilliertem Wasser bewegten sich zwischen 5-13 Tagen bei 30 °C, 14-37 Tagen bei 20 °C, 62-197 Tagen bei 10 °C und 205-558 Tagen bei 0 °C und 202-642 Tagen bei 10 °C. Die virale Persistenz war kĂŒrzer in OberflĂ€chenwasser im Vergleich zu destilliertem Wasser und dieser Trend war bei unterschiedlichen Temperaturen variabel: bei 30 °C und 20 °C war die Persistenz 3-5 mal kĂŒrzer, wĂ€hrend sie bei niedrigeren Temperaturen in OberflĂ€chenwasser 8-12 mal kĂŒrzer war als in destilliertem Wasser. Die mikrobiologischen Analysen zeigten eine Zunahme im Bakteriengehalt bei den mit Virus beimpften OberflĂ€chenwasserproben bei der Lagerung bei 30 °C, 20 °C und 10 °C. Um die StabilitĂ€t von viraler RNA in OberflĂ€chenwasserproben zu untersuchen, wurden mit H4N6-Virus, H5N1-Virus und H6N8-Virus beimpfte OberflĂ€chenwasserproben mit der qRRT-PCR zu Beginn der Versuche und nach der Lagerung bei den verschiedenen Temperaturen untersucht. Eine signifikante Menge an viraler RNA war in den kontaminierten Wasserproben bei allen Temperaturen noch feststellbar, nachdem das Virus bei der Titration in Zellkultur nicht mehr nachweisbar war. Die Rate des viralen RNA-Abbaus war grĂ¶ĂŸer bei hohen als bei niedrigeren Temperaturen.
Eine KeimtrĂ€gertechnik wurde angepasst, um die Persistenz von Influenzaviren in verschiedenen Substraten zu untersuchen. Elektropositiv geladene Zeta Plus Virosorb-Filterscheiben, die in einer Polycarbonat-Membran mit einer PorengrĂ¶ĂŸe von 10 nm eingepackt waren, wurden als Sandwich-KeimtrĂ€ger verwendet. Um die Adsorption von Influenzaviren an die Filterscheiben zu ermöglichen, wurde Phosphatbeladungspuffer mit 3 unterschiedlichen pH-Werten (6,00; 6,50 und 7,40) getestet. KeimtrĂ€ger mit hohen Virustitern wurden mit Phosphatbeladungspuffer bei einem pH-Wert von 7,40 erzeugt. Außerdem wurde ein enormer Verlust bei der Viruskonzentration beobachtet, wenn Filterscheiben, die mit H5N1 beimpft waren, ĂŒber 6 h trocken aufbewahrt wurden, wĂ€hrend der Verlust der Viruskonzentration nur geringfĂŒgig war, wenn die beladenen Filterscheiben unter feuchten Bedingungen gelagert wurden. Sandwich-KeimtrĂ€ger wurden zuerst verwendet, um die Persistenz der Influenzaviren und der Modellviren in OberflĂ€chenwasser abzuschĂ€tzen. Die Persistenz von allen Viren war bei 10 °C am höchsten, gefolgt von 0 °C, 10 °C, 20 °C und 30 °C. Bei 10 °C resultierte ein einziger Gefrier-Auftau-Zyklus unabhĂ€ngig von der Lagerdauer in einer abrupten Abnahme im Virustiter, gefolgt von einer Langzeitpersistenz. Interessanterweise persistierten AIV lĂ€nger in OberflĂ€chenwasser, wenn sie an KeimtrĂ€gern absorbiert waren, als wenn sie frei in Wasser suspendiert waren. Die D-90-Werte der an Filter adsorbierten AIV nahmen um das drei- bis vierfache bei 10 °C, um das zweifache bei 0 °C, 20 °C und 30 °C und nur geringfĂŒgig bei 10 °C im Vergleich zu frei suspendierten Viren zu. In Wasserproben, in denen die KeimtrĂ€ger gelagert wurden, wurde kein Virus nachgewiesen, wĂ€hrend die Influenzaviren und Modellviren von den Filterscheiben, die bei niedrigen Temperaturen gelagert wurden, wĂ€hrend des ganzen Untersuchungszeitraums erfolgreich eluiert und quantifiziert werden konnten. Dies erlaubt den Einsatz der Technik bei TenazitĂ€tsuntersuchungen in großtechnischem Maßstab.
Das Überleben der Influenzaviren und der Modellviren wurde ebenso in Seesediment, Entenkot und Fleisch unter der Verwendung der Sandwich-KeimtrĂ€gertechnik zahlenmĂ€ĂŸig bestimmt. Unter all diesen Substraten war die virale Persistenz in Seesediment am höchsten, verglichen mit Entenkot und Fleisch, in denen die Viruspersistenz Ă€hnlich war. In Seesediment war die Persistenz von AIV sogar höher als in OberflĂ€chenwasser, was anzeigt, dass Sediment die Viren vor den Inaktivierungsfaktoren, die in der Umwelt vorhanden sind, schĂŒtzen und somit das Überleben der Viren verlĂ€ngern kann. In Entenkot schwankten die D-90-Werte der Influenzaviren von 1-2 Tage bei 30 °C, 4-7 Tage bei 20 °C, 14-21 Tage bei 10 °C, 47-75 Tage bei 0 °C und 53-71 Tage bei 10 °C. In Entenfleisch wurden sehr Ă€hnliche D-90-Werte ermittelt.
Zwei Modellviren (NDV und ECBO-Virus) wurden in die Studie aufgenommen, stellvertretend fĂŒr behĂŒllte und unbehĂŒllte Modellviren und fĂŒr den direkten Vergleich mit Influenzaviren, da sie als Testorganismen fĂŒr virale TenazitĂ€tsuntersuchungen dienen. Im Allgemeinen war die Persistenz von NDV und ECBO-Viren in allen Wasserarten und in all den Substraten durchweg höher als die der Influenzaviren. Von den Modellviren hatte jedoch ECBO-Virus als ein unbehĂŒlltes Virus die höheren D-90-Werte, wĂ€hrend das behĂŒllte NDV die niedrigeren D-90-Werte hatte, die bei allen Temperaturen denen der Influenzaviren Ă€hnlich waren. Dies zeigt, dass NDV ein Surrogat-Virus fĂŒr Persistenz- und Inaktivierungsuntersuchungen an AIV sein kann, indem es eine leicht höhere TenazitĂ€t als diese Viren hat, was einen ausreichenden Sicherheitsspielraum bei der Interpretation von Ergebnissen gewĂ€hrleistet.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstreichen die Wichtigkeit der Wasserbiotope beim Fortbestand und bei der Verbreitung von AIV in der Umwelt. Bei niedrigen Temperaturen können AIV in OberflĂ€chenwasser, Seesediment, Entenkot und Fleisch ĂŒber einen lĂ€ngeren Zeitraum infektiös bleiben, was die Persistenz der Viren in der Umwelt ĂŒber den Winter ermöglicht.
Kurzfassung auf Englisch: The present study was designed to investigate the persistence of AIV in a variety of contaminated media and substrates under diverse environmental conditions. Wild aquatic birds serve as a reservoir of influenza A viruses. The infected birds excrete a large number of viruses through their nasal secretion and feces that leads to heavy contamination of the environment. In order to determine the tenacity of these viruses under natural environmental conditions, the persistence of three LPAI viruses (H4N6, H5N1, H6N8), one human influenza virus (H1N1), and two model viruses (NDV and ECBO) was calculated in various types of waters (DW, NS, and SW), lake sediment, duck feces, and duck meat at -10, 0, 10, 20, and 30 °C for extended periods of time.
The NDV and influenza viruses were propagated in the allantoic sac of 9-11 day old SPF chicken embryos while ECBO was propagated in MDBK. For the tenacity studies in water, DW and NS were autoclaved while SW collected from Lake Constance was used without any treatment. Viral quantitation was performed in the beginning of trials and then afterwards at regular intervals by the end point serial dilution method on MDCK for influenza viruses, Vero cells for NDV, and MDBK for ECBO. The virus titers were calculated as TCID50/ml by the Spearman-KĂ€rber method. Duplicate samples were tested each time for all of the treatment groups for a maximum of 36 weeks. The sequential data thus obtained was analyzed by a linear regression model to calculate T-90 values (time required for one log reduction in the virus titer) and the estimated persistence of viral infectivity with a starting viral concentration of 106.00 TCID50/ml.
The infectivity of the influenza viruses was preserved for a maximum period of time in DW followed by in NS and SW and the individual influenza viruses were also inconsistent in their sensitivity to inactivation under all experimental conditions. T-90 values of the influenza viruses in the inoculated DW ranged between 5-13 days at 30 °C, 14-37 days at 20 °C, 62-197 days at 10 °C, 205-558 days at 0 °C, and 202-642 days at -10 °C. The viral persistence was shorter in SW than DW and this trend was variable at different temperatures: at 30 and 20 °C the persistence was 3-5 times shorter while at lower temperatures it was 8-12 times shorter in SW than in DW. The microbiological analysis showed an increase in the bacterial counts of the virus inoculated SW samples after storage at 30, 20, and 10 °C. To check the stability of viral RNA in the SW samples, H4N6, H5N1, and H6N8 inoculated SW samples were processed for quantitation of viral RNA by qRRT-PCR reaction at the start of the experiments and after storage at various temperatures. A significant amount of viral RNA was still detectable in the contaminated water samples at all temperatures after the virus was no longer detectable by cell culture titration. The rate of viral RNA degradation was faster at high temperatures than at lower ones.
A germ carrier technique was adapted to study the persistence of influenza viruses in various substrates. Electro positively charged Zeta Plus Virosorb filters discs wrapped in a polycarbonate membrane of 10 nm pore size were used as sandwich germ carriers. To facilitate the adsorption of influenza viruses to the filter discs, PLB adjusted to three pH values (6.00, 6.50, and 7.40) was checked and the one with a pH 7.40 produced germ carriers with high virus titer. Furthermore, an enormous loss of virus titer was recorded when the filter discs inoculated with H5N1 virus were kept dry for 6 hours while a negligible loss of the virus titer was observed when loaded filter discs were kept under moist conditions. Sandwich germ carriers were first used to estimate the persistence of influenza and model viruses in SW. Persistence of all of the viruses was highest at -10 °C followed by 0, 10, 20, and 30 °C. At -10 °C, the single freeze-thaw cycle resulted in an abrupt decline in the virus titer, followed by long term persistence. Interestingly, the AIV persisted longer in SW using the germ carrier technique as compared to suspending the viruses in the water. The T-90 values of the filter bound AIV increased three to four folds at -10 °C, two-fold at 0, 20, and 30 °C, and slightly at 10 °C compared to the suspended viruses in the SW. No virus was detected in water samples in which germ carriers were incubated while successful recovery of eluable virus from filter discs stored at low temperatures was possible for influenza and model viruses during whole study period, making the technique suitable for use in large-scale tenacity studies.
The survival of influenza and model viruses was also evaluated in lake sediment, duck feces, and meat using the sandwich germ carrier technique. Among all of these substrates, viral persistence was highest in the lake sediments as compared to duck feces and meat, in which the virus persistence was quite similar. In lake sediment, the persistence of the AIV was even higher than in the SW which indicates that sediment can protect the viruses from the inactivating factors present in the surrounding environment and prolong viral survival. In duck feces, the T-90 values of influenza viruses ranged from 1-2 days at 30 °C, 4-7 days at 20 °C, 14-21 days at 10 °C, 47-75 days at 0 °C, and 53-71 days at -10 °C and equivalent T-90 values were also recorded in the duck meat.
Two model viruses were incorporated into this study to serve as representative enveloped and non-enveloped model viruses and for direct comparison with influenza viruses as these viruses serve as test organisms in viral tenacity studies. Generally, in all of the water types and within all of the substrates, the persistence of NDV and ECBO viruses was consistently higher than that of influenza viruses. However, of the model viruses, ECBO as a non-enveloped virus had higher T-90 values while NDV, as an enveloped virus, had lower T-90 values which are much closer to those of the influenza viruses at all temperatures. This indicates that NDV may be a good surrogate virus for studying the persistence and inactivation of AIV, as it has a slightly higher tenacity than those viruses, allowing for a sufficient margin of safety in interpretation of results.
The findings of the present study underline the importance of the aquatic habitat in the maintenance and spread of AIV in the environment. At lower temperatures, AIV can remain infectious in SW, lake sediments, duck feces, and meat for extended periods of time, allowing persistence of the viruses in the environment over winter.
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