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Untersuchung des signalvermittelten Kerntransportes von DFF (DNA-Fragmentierungsfaktor) durch Importin alpha 3/ Importin beta

Investigation of signal dependent nuclear transport of DFF (DNA-Fragmentation-Factor) by Importin alpha 3/Importin beta

M├╝ller, Wibke


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-60077
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/6007/

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Universität Justus-Liebig-Universit├Ąt Gie├čen
Institut: Institut f├╝r Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der m├╝ndlichen Pr├╝fung: 08.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 14.07.2008
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurden die Kernlokalisationssequenzen der Untereinheiten des DFF-Komplexes, der murinen Nuklease CAD und des humanen und murinen Inhibitors DFF45/ICAD-L, anhand von fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen untersucht und klassifiziert. Bereits zu Beginn der Arbeit war bekannt, dass im C-Terminus beider DFF-Untereinheiten Kernlokalisationssignale, gepr├Ągt von basischen Aminos├Ąureresten, zu finden sind. Um herauszufinden, ob es sich um ein- oder zweiteilige Kernlokalisationssignale handelt, wurden EGFP- und DsRedMonomer-fusionierte Deletionsmutanten, sowie Mutanten mit Austausch einzelner basischer Aminos├Ąuren generiert und die Lokalisation in eukaryontischen Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dabei zeigte sich, dass DFF40/CAD ein nicht-klassisches NLS mit zwei benachbarten basischen Aminos├Ąureresten beinhaltet, die f├╝r den Kerntransport von Bedeutung sind. In DFF45/ICAD-L wurde ein klassisch einteiliges Kernlokalisationssignal gefunden. Des Weiteren wird in dieser Arbeit gezeigt, dass f├╝r den effektiven Transport des DFF-Komplexes die Kernlokalisationssignale beider Untereinheiten von Bedeutung sind. Au├čerdem konnte gezeigt werden, dass der heterodimere Komplex aus Importin alpha und Importin beta den Kerntransport von DFF bewerkstelligt, wobei die Isoform Importin alpha 3 als bedeutendster Rezeptor ermittelt werden konnte. Durch Untersuchung der Topologie der Bindung von DFF zeigte sich, dass DFF40 an die sekund├Ąre und DFF45 an die prim├Ąre Bindestelle bindet, was vermuten l├Ąsst, dass ein Heterodimer aus DFF40/DFF45 von einem Importin alpha 3-Molek├╝l gebunden wird. Die Cluster basischer Aminos├Ąuren in DFF40 und DFF45 imitieren dabei die Konsensussequenz eines klassisch zweiteiligen Kernlokalisationssignales. Mikroskopische Untersuchungen, basierend auf unterschiedlicher Fluoreszenzfarbe der beiden Untereinheiten von DFF, unterst├╝tzen die Annahme, dass DFF in vivo als Tetramer DFF402/DFF452 in den Zellkern transportiert wird.
Unter Ber├╝cksichtigung aller erhaltenen Ergebnisse konnte folgendes Kerntransportmodell aufgestellt werden: Ein Tetramer DFF402/DFF452 wird von je zwei Molek├╝len Importin alpha 3/Importin beta in den Kern transportiert, wobei ein Importin alpha -Molek├╝l einen Heterodimer aus DFF40 und DFF45 ├╝ber C-terminale Kernlokalisationssignale an die prim├Ąre und sekund├Ąre NLS-Bindestelle bindet.
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