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Enterobacter sakazakii : Risikoprofil und Untersuchungen zum Nachweis in Säuglingsnahrungen

Sanjaq, Suhad


Originalveröffentlichung: (2008) Giessen : VVB Laufersweiler 2007
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.444 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-54959
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2008/5495/


Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Institut f√ľr Angewandte Mikrobiologie
Fachgebiet: Agrarwissenschaften und Umweltmanagement
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5244-7
Sprache: Deutsch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 13.01.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 29.02.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Bakterielle Infektionen durch Enterobacter (E.) sakazakii bei S√§uglingen, die durch Verunreinigungen in S√§uglingsmilchpulvernahrung verursacht wurden, sind seltene jedoch gravierende Erkrankungen mit potenziell t√∂dlichem Ausgang. Neben den Salmonellen ist dieser der einzige Keim, bei dem ein Kausalzusammenhang zwischen der Erkrankung von S√§uglingen und der Kontamination von S√§uglingsmilchpulvernahrung nachgewiesen werden konnte. Entsprechend der durch die CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION vorgegebenen Grundelemente des Risikoprofils wurde in diesen Untersuchungen die Matrix/Erreger-Kombination von ‚ÄěE. sakazakii in S√§uglingsnahrung‚Äú eingehend mit Hilfe von bereits vorhandenen Literaturdaten untersucht. Dabei lag der Fokus der Arbeit auf Elementen des Risikoprofils, die eine Eliminierung oder Minimierung der Gef√§hrdung bereits im Produktionsprozess zum Ziel haben. Au√üerdem wurde der Evaluierung der Methoden zur Qualit√§tskontrolle besondere Beachtung geschenkt.
Das Ziel dieses Risikoprofils liegt in der Bereitstellung von Hintergrundinformationen, basierend auf dem aktuellen Wissensstand der Literatur und eigenen Untersuchungen. Die Ergebnisse der hier vorgenommenen Erhebung lassen sich wie folgt zusammenfassen: Infektionen mit E. sakazakii werden h√§ufig durch die Kontamination von S√§uglingsmilch-pulver verursacht und f√ľhren zu Septik√§mien, nekrotisierenden Enterocolitiden und vor allem zu Meningitiden. Hierbei sind stets Neu- (< 28 Tage) und insbesondere Fr√ľhgeborene und immungeschw√§chte S√§uglinge betroffen. Weltweit konnten bisher bis zu 40 Erkrankungs-ausbr√ľche mit 60 bis 80 betroffenen S√§uglingen registriert werden. Ungef√§hr ein Drittel dieser Erkrankungen konnte mit S√§uglingsnahrung assoziiert werden.

Der Gro√üteil dieser Infektionen ist jedoch auf Kontaminationen durch das Produktionsumfeld sowie auf einzelne Rohstoffe zur√ľckzuf√ľhren. Einige Schl√ľsseleigenschaften des Keims sind nach wie vor ungekl√§rt, wie z. B. die Virulenzfaktoren. Andere Eigenschaften wie Trocken-resistenz und Biofilmbildung konnten durch eigene Untersuchungen charakterisiert werden. Als problematisch erwies sich insbesondere die hohe Trockenresistenz des Bakteriums, da diese Rekontaminationen des Endprodukts aus dem Produktionsumfeld bedingen. Dazu wurden detaillierte Untersuchungen zum Vorkommen von E. sakazakii im Produktionsumfeld und Rohstoffen durchgef√ľhrt. Die Untersuchungen zur Trockenresistenz haben gezeigt, dass sich die Keimzahl in mit E. sakazakii versetztem Milchpulver nach Trocknung und Lagerung in 14 Wochen um nur drei Zehnerpotenzen verringerte und auch noch nach 61 Wochen zu detektieren war. Die Beseitigung einer E. sakazakii-Kontamination wird durch diese besondere Widerstandsf√§higkeit des Keimes erschwert. Ein fortgesetzter Eintrag des Bakteriums √ľber pflanzliche Rohstoffe konnte durch die Identifizierung kritischer Rohstoffe als zweite Kontaminationsquelle, neben der Pr√§senz des Bakteriums im Produktionsumfeld, festgestellt werden.

Bez√ľglich der Strategien der Gefahrenkontrolle wurden einerseits Methoden der Qualit√§tskontrolle eingehend untersucht und au√üerdem Versuche zu Wachstumskinetiken vor dem Hintergrund der aktuellen Zubereitungs- und Anwendungsempfehlungen durchgef√ľhrt. Die Einhaltung der empfohlenen Richtlinien f√ľr die Zubereitung, Handhabung, Lagerung und Anwendung von S√§uglingsanfangsnahrungen kann das Risiko nahezu eliminieren. Dennoch wird f√ľr besonders gef√§hrdete S√§uglinge, Neu- (< 28 Tage) und Fr√ľhgeborene und immungeschw√§chte S√§uglinge angeregt, nur handels√ľbliche sterile Fl√ľssignahrung zu verabreichen.

Die Qualit√§tskontrollma√ünahmen sind ein wichtiges Element des Risikomanagements. Ihre Effektivit√§t ist in besonderem Ma√üe von der Leistungsf√§higkeit der angewandten Methoden abh√§ngig. Darum wurden verschiedene kultivierungsabh√§ngige, biochemische und molekularbiologische Methoden getestet. Als besonders effektiv erwiesen sich die chromogenen N√§hrmedien sowie die spezifischen PCR-Nachweissysteme, w√§hrend sich die kultivierungsabh√§ngige Detektion durch Gelbf√§rbung der Kolonien und die √úberpr√ľfung des biochemischen Leistungsspektrums als ungen√ľgend erwiesen. Mit den erarbeiteten molekularbiologischen Methoden l√§sst sich eine sichere Identifizierung innerhalb k√ľrzester Zeit (3 Tage) gew√§hrleisten. Die Methoden sind f√ľr den Routinebetrieb einer industriellen Produktion standardisierbar und auch unter diesen Bedingungen von hoher Reproduzierbarkeit.
Eine schnelle, sensitive und spezifische Methode zur Detektion und Identifikation dieses opportunistischen Erregers ist f√ľr die Lokalisierung der Infektionsquelle von Bedeutung. An die Identifizierung schlossen sich Typisierungsverfahren zur weitergehenden Charakterisierung von E. sakazakii-Isolaten unterschiedlicher Herkunft (Rohstoffe, Umfeld, Endprodukte) an. Aufgrund von ph√§notypischen Eigenschaften und durch die spezifische PCR konnten fast alle Isolate der Spezies E. sakazakii zugeordnet werden. Eine abschlie√üende molekulare Charakterisierung erfolgte f√ľr eine Auswahl an E. sakazakii-Isolaten durch die Makrorestriktion der chromosomalen DNA und anschlie√üender Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), um die Kontaminationsquellen und Kontaminationswege zu identifizieren und um die Eignung der Methoden zur R√ľckverfolgung von Kontaminationen zu pr√ľfen. Dabei konnten 37 Restriktionsmuster (P1-P37) unterschieden werden. Hinsichtlich der Restriktionsmuster in der PFGE wiesen die Isolate aus dem gleichen Herkunftsort √ľberwiegend jeweils ein einheitliches Restriktionsmuster auf. In mehreren F√§llen waren jedoch bereits deutliche Unterschiede im Restriktionsmuster selbst f√ľr Isolate aus einem Herkunftsort festzustellen. Die gr√∂√üte genotypische Vielfalt wurde mit siebzehn unterschiedlichen Restriktionsmustern aus einem Herkunftsort festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass die Kontaminationsquellen von S√§uglingsnahrung mit E. sakazakii sehr vielf√§ltig und damit wahrscheinlich nicht einer einzigen Quelle zuzuordnen sind. Eine weitere molekulare Charakterisierung der Isolate war durch die Randomly Amplified Polymorphic DNA Methode (RAPD) m√∂glich. Die Ergebnisse der RAPD zeigten √§hnliche Muster von verwandten Isolaten wie die PFGE, dabei zeigten beide Methoden eine √§hnliche hohe diskriminatorische St√§rke auf.

F√ľr eine ausreichende Sicherung des Gesundheitsschutzes des Verbrauchers und die Gew√§hrleistung der Produktqualit√§t konnte die Evaluierung des Risikos f√ľr das Vorkommen von E. sakazakii in S√§uglingsnahrung anhand der ermittelten Daten und der Literatur-angaben erfolgen. Folglich best√§tigt dies die Festlegung des Grenzwertes von 0 KbE/30x10 g durch die Europ√§ische Union (VO/EG Nr. 2073/2005), nachdem in 30 Proben zu je 10 g Trockenmilchnahrung kein E. sakazakii nachweisbar sein darf. Als Ergebnis dieser Arbeit ist festzustellen, dass zur Kontrolle dieses Grenzwertes ein breites Spektrum kultivierungsabh√§ngiger und molekularbiologischer Methoden vorliegt.

Dennoch besteht vor dem Hintergrund der ergriffenen Produktionshygienema√ünahmen durch die Produzenten bei der S√§uglingsnahrung auf Milchpulverbasis ein mikrobiologisches Restrisiko, da es sich hier nicht um ein steriles, sondern um ein keimarmes Produkt handelt. Sofern aber das S√§uglingsmilchpulver hygienisch einwandfrei zubereitet und mit diesem auch hygienisch umgegangen wird, ist das Risiko einer E. sakazakii-Infektion bei S√§uglingen nahezu ausgeschlossen. Zur Infektionsvorbeugung sind Hinweise zur Zubereitung, Handhabung und Lagerung von S√§uglingsnahrungen im Sinne einer Guten-Hygiene-Praxis immer zu ber√ľcksichtigen. Angaben auf der Verpackung, wie ‚ÄěS√§uglingsnahrung in Pulverform immer frisch herstellen, abgekochtes Wasser verwenden, anger√ľhrte Nahrung sofort auf Trinktemperatur abk√ľhlen und verf√ľttern und Nahrungsreste nicht wieder verwenden‚Äú, sind unerl√§sslich, um einer Infektion mit E. sakazakii vorzubeugen. Eine Vermehrung von E. sakazakii in S√§uglingsnahrung nach einer inad√§quaten Handhabung (z. B. Herstellung auf Vorrat, Lagerung zubereiteter S√§uglingsnahrung) durch den Verbraucher muss als eines der Hauptrisiken gelten. Eine Sensibilisierung der Verbraucher und des Klinikpersonals ist notwendig, um darauf aufmerksam zu machen, dass es sich bei der S√§uglingsnahrung nicht um ein steriles, sondern um ein keimarmes Produkt handelt.
Kurzfassung auf Englisch: Enterobacter sakazakii - Risk profile and investigations of the pathogen detection in infant food

Enterobacter (E.) sakazakii is a rare cause of invasive infection with high death rates in neonates. The fatal infection is associated with the presence of the organism in commercial powdered formula fed to the infant. Contamination of powdered infant formula with E. sakazakii and with Salmonella has been proved as the cause of infection in infants, sometimes with serious sequel of death. This thesis investigated the food/hazard combination of E. sakazakii in infant milk formula in accordance with the basic elements of a risk profile given by the CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. It focused on the risk factors and how they could be eliminated or minimised already in the process of production.
The risk profile aims to summarise the recent knowledge based on literature data and own investigations. The evaluation results can be summarised as follows: Infections with E. sakazakii are often caused by the contamination of infant milk formula and lead to septicaemias, necrotizing enterocolitis and meningitis. The most vulnerable group are newborn (<28 days), particularly preterm and immunocompromised infants. Up to 40 outbreaks with 60 to 80 affected infants could be registered worldwide. About one third of these illnesses could be associated with baby food.

There are two main routes by which E. sakazakii can enter reconstituted infant formula: a) through intrinsic contamination - either through contaminated ingredients added after drying or from the processing environment after drying and before packing or b) through external contamination of the formula during reconstitution and handling e.g. through poorly cleaned utensils. In addition, pathogen properties contribute to its infectious accessibility. Although, some of the E. sakazakii key properties such as the virulence factors are still unclear, others like resistance to drying stress and biofilm formation are well defined by own investigations. The later might be implicated in the recontamination of the end product.

A long term study on the dry resistance has shown that the initial amount of E. sakazakii in dry infant formula has dropped within 14 weeks only by 3 logs and has been still detectable after 61 weeks. This higher resistance against dryness makes it more difficult to control the problems of contaminations with E. sakazakii. A continuous entry of the bacterium by raw materials has been seen by the identification of critical raw materials as the second contamination source beside the presence of the bacterium in the production environment.

With regard to the hazard strategies, the quality control methods were investigated. Additionally, the study of growth kinetics of E. sakazakii in infant formula was carried out to assess the recommended guidelines for the preparation, use, storage and application of starter formula which can nearly eliminate the risk. However, for high-risk infants like neonates (<28 days) particularly preterm and immunocompromised it is recommended to use sterile ready to use formula only.

The quality control measures are important elements in the risk management. Their effectiveness depends on the quality of methods being used. Thus, conventional, biochemical and molecular methods were performed for the sake of comparison. While, the chromogenic media and the specific PCR methods were defined as highly effective methods, the conventional method with a selection procedure based on yellow pigmentation and biochemical reactions was found unreliable. A safe and fast (3 days) detection should be guaranteed by the developed molecular methods. The methods should be used as standardised methods with a high reproducibility in the industrial routine lab.

A quick, sensitive and specific method for the detection and identification of this opportunistic infant pathogenic bacterium is very important for the localisation of the infection. Both identification and typing methods for the characterisation of E. sakazakii isolates of different sources (raw material, environment, and end product) were investigated. All investigated isolates were identified as E. sakazakii by using phenotypical characteristics and specific PCR methods.
Furthermore, E. sakazakii isolates were investigated by macrorestriction analysis of their chromosomal DNA followed by pulse field gelelectrophoresis (PFGE) to identify the source and the way of contamination and prove this method to trace back the contamination route. The restriction patterns obtained by pulsed-field gel electrophoresis displayed identical or almost identical patterns for the cultures of various sources. In addition, a total of 37 distinct patterns (P1-P37) were observed. With reference to the restriction patterns obtained by pulsed field gel electrophoresis, identical patterns for strains of the same source were realised. Nevertheless, in several cases clear differences were distinguished in the restriction pattern for isolates from the same source. The largest genotypical variety was detected for seventeen different restriction patterns from the same source. This implies that the sources of contamination with E. sakazakii in infant food are very various and it is of high probability that the contaminations are to be assigned to not only one source. Further molecular characterisations of the isolates were possible by the Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD). The results of the RAPD revealed similar patterns as in the PFGE for related isolates. Both methods showed a similar high discriminatory power.


An evaluation of E. sakazakii contamination risk in infant milk powder based on literature data and own investigations confirms the safety limit of absence of E. sakazakii in 30x10g set by the European directive (VO/EG No. 2073/2005). Upon the investigation results, the availability of a wide range of conventional microbiological and molecular methods can be effectively used and are reliable.

Nevertheless, powdered infant milk formula is in terms of the manufacturer hygiene measures not a sterile product but is at risk of being contaminated. Concerning the preparation and handling of the infant milk formula under good hygiene conditions, there should be no risk for infants to get an infection with E. sakazakii. To prevent infections, general information about the use and storage of powdered infant formula has to be taken into consideration of a good hygiene practice. There is a general need for the labelling of the product with ‚Äúprepare reconstituted formula freshly, cooling before reconstituted formula is fed. Remnants of feed should be discarded and not used as part of the following feed‚ÄĚ. A risk increase caused by mishandling of the reconstituted formula by the consumer can not be excluded. The fact that powdered infant formula is not a sterile product requires more attention of the user in domestic and hospital environment for the right way of preparation and use of infant milk formula. Over and above, risk management strategies have to be developed in order to address the presence of E. sakazakii in this product.
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