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Molekular- und zellbiologische Analyse des Invasionsmechanismus von Listeria monocytogenes in eukaryontische Zellkulturen

Pashalidis, Philippos Benedikt


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-4924
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2001/492/


Freie Schlagwörter (Deutsch): Listeria monocytogenes , Invasionsmechanismus , eukaryontische Zellkultur
Universität Justus-Liebig-UniversitĂ€t Gießen
Institut: Zentrum fĂŒr Medizinische Mikrobiologie und Virologie, Institut fĂŒr Medizinische Mikrobiologie, Klinikum der Justus-Liebig-UniversitĂ€t Giessen
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mĂŒndlichen PrĂŒfung: 04.07.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 22.08.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Der Krankheitserreger L. monocytogenes ist ein v.a. fĂŒr Feten und immunsupprimierte Personen gefĂ€hrliches Bakterium. Eine recht
unspezifische Klinik und die Vermehrung des Keimes in Lebensmitteln unter anspruchslosen Bedingungen machen die durch L.
monocytogenes ausgelöste Listeriose zu einer ernstzunehmenden Krankheit mit zahlreichen Manifestationsformen. Besonderes Interesse
erlangt dieses Bakterium in zahlreichen Untersuchungen auch deswegen, weil es in der Lage ist, verschiedene Gewebe bzw. Barrieren
des Körpers zu ĂŒberwinden. Sowohl die Darmbarriere als auch die Blut-Hirn- und Plazentaschranke können ĂŒberwunden werden, was u.a.
zu den vielfĂ€ltigen Manifestationsformen der Erkrankung fĂŒhrt. Die Erforschung der Invasionsstrategien von L. monocytogenes wird durch
die Möglichkeiten von Infektionsmodellen (Maus, Zellkultur) und genetischen VerÀnderung der Bakterien (Transposon-Mutanten,
Transformation mit Plasmid-DNA, Komplementation von Deletionsmutanten) unterstĂŒtzt.


In dieser Arbeit wurde zunÀchst das offene Leseraster ORFA und das inlAB-Operon von L. monocytogenes EGD 1/2a sequenziert und mit
der bekannten Sequenz von L. monocytogenes EGD-SmR (Gaillard et al., 1991) verglichen. Die Genprodukte des inlAB-Operons sind
entscheidend am Invasionsmechanismus in eukaryontische Zellen beteiligt. Der Vergleich ergab eine sehr hohe Homologie und damit
nahezu identische Nukleotidsequenzen. Somit konnte davon ausgegangen werden, daß der in dieser Arbeit verwendete Stamm EGD sehr
Ă€hnliche Voraussetzungen fĂŒr die Invasion hat wie der in der Literatur beschriebene LO28. Die Auswirkung der genetischen Unterschiede
und damit der Unterschiede in der AminosĂ€uresequenz auf die rĂ€umliche Struktur der Proteine muß mit Verfahren wie der
Röntgen-Strukturanalyse weiter abgeklÀrt werden.


Die Komplementation der [Delta]inlAB2-Deletionsmutanten mit verschiedenen rekombinanten Plasmiden des Vektors pERL-3 und die
ÜberprĂŒfung der StĂ€mme in Invasionsassays ergab unterschiedliche AbhĂ€ngigkeiten von den Proteinen InlA und InlB je nach Zellinie. Diese
Ergebnisse stĂŒtzen daher den von Dramsi geprĂ€gten Begriff des 'Zelltropismus', mit dem die unterschiedlichen AbhĂ€ngigkeiten
beschrieben werden (Dramsi et al., 1995). Das Bakterium verfĂŒgt durch die Internaline und deren unterschiedliche Effekte in verschiedenen
Zellinien ĂŒber eine große VariabilitĂ€t, die als Ausdruck der VariabilitĂ€t in vivo gesehen werden kann.


Die Komplementation von L. innocua mit verschiedenen rekombinanten Plasmiden des Vektors pERL-3 und die durchgefĂŒhrten
Invasionsassays zeigten, daß der an sich nicht-invasive Stamm mit dieser Technik der genetischen VerĂ€nderung invasiv gemacht werden
kann, wenn auch die Invasionsraten erheblich unter denen der [Delta]inlAB2-Komplementante lagen. Der Zelltropismus zeigte sich auch in
diesen Untersuchungen, war aber nicht identisch mit den Ergebnissen der [Delta]inlAB2-Komplementanten.


Durch die Komplementation der Deletionsmutante [Delta]vgc2 mit rekombinanten Plasmiden des Vektors pLiga164 konnte die Rolle des
Regulationsfaktors PrfA nĂ€her beleuchtet werden. PrfA ist in der Lage, auch ĂŒber die Aktivierung des actA-Promotors die Expression von
InlB und damit die Invasion gegenĂŒber dem Wildtyp L. monocytogenes zu steigern. Da der Deletionsmutante [Delta]vgc2 alle bekannten
Virulenzgene fehlen, bedeutete die starke Invasion nach Komplementation mit dem die Gene prfA, inlA und/oder inlB tragenden Vektor,
daß die anderen Virulenzgene fĂŒr den Invasionsprozeß dieser Mutante nicht von Bedeutung sein mĂŒssen.


Die Komplementation von L. innocua mit den verschiedenen Derivaten des Vektors pLiga164 ergab im Invasionsassay niedrigere
Invasionszahlen als die Komplementation von [Delta]vgc2. Da auch [Delta]vgc2 wie L. innocua die bekannten Virulenzgene fehlen, muß
ein oder mĂŒssen mehrere noch unbekannte Faktoren in L. monocytogenes zur effizienteren Invasion beitragen.


In dieser Arbeit konnte ferner gezeigt werden, daß das von S. MĂŒller gereinigte Protein InlB biologisch aktiv ist. Dazu wurden verschiedene
Listerien-StÀmme mit dem Protein vorinkubiert, woraufhin das Protein an die Bakterien binden und InvasivitÀt wiederherstellen oder
steigern konnte.
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