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HSV/AAV-Hybridamplikonvektoren zur stabilen Transduktion humaner Zellen

Klucken-Swyen, Heidi


Originalveröffentlichung: (2007) Giessen : VVB Laufersweiler 2007
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (12.078 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-48355
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4835/

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Universität Justus-Liebig-UniversitĂ€t Gießen
Institut: Institut fĂŒr Virologie; Klinik fĂŒr Kinder-Onkologie, -HĂ€matologie und -Immunologie, Zentrum fĂŒr Kinder- und Jugendmedizin, Heinrich-Heine-UniversitĂ€t DĂŒsseldorf
Fachgebiet: VeterinÀrmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-5188-4
Sprache: Deutsch
Tag der mĂŒndlichen PrĂŒfung: 04.07.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 16.08.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Humane hĂ€matopoetische und mesenchymale Stammzellen sind attraktive Zielzellen fĂŒr die Gentherapie. Eines der Hauptprobleme des stabilen Gentransfers in Zellen ist die durch zufĂ€llige chromosomale Integration verursachte maligne Transformation. Die adeno-assoziierten Viren (AAV) sind die einzigen integrierenden Viren, die eine spezifische Integration vermitteln. In den vergangenen Jahren wurden hybride HSV/AAV- Amplikonvektoren entwickelt, die Elemente der Herpes simplex Viren-Typ 1 (HSV-1) und der AAV-Typ 2 miteinander vereinen. Die große VerpackungskapazitĂ€t des HSV- Amplikonvektors ermöglicht die Verpackung der essentiellen AAV-Elemente fĂŒr die spezifische Integration und des Transgens in cis im gleichen Vektor. Verpackt in die herpesvirale HĂŒlle transduzieren die Vektoren mit hoher Effizienz.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunĂ€chst einleitende Transduktionsexperimente mit dem HSV/AAV-Hybridamplikonvektor HSV/AAV durchgefĂŒhrt, welcher das grĂŒne Fluoreszenzprotein (GFP) exprimiert, das zwischen den AAV-ITRs lokalisiert ist. Nach Transduktion verschiedener lymphohĂ€matopoetischer Zelllinien konnte die höchste Transduktionseffizienz von ca. 70% in der den Stammzellen am nĂ€chsten stehenden humanen myeloischen LeukĂ€miezelllinie KG1a beobachtet werden. In der humanen T-Zell-LeukĂ€miezelllinie Jurkat lag die Transduktionseffizienz nach Transduktion mit der gleichen Vektormenge bei ca. 40%. Die Transgenexpression war in beiden Zelllinen nach der TransduktionĂŒber 6 Tage stabil und nahm dann zĂŒgig ab. In der humanen Nierenzelllinie 293, die als Modellzelllinie zur Integrationsanalyse eingesetzt wurde, lag die Transgenexpression nach Transduktion mit dem HSV/AAV-Hybridamplikonvektor HSV/AAV am 91. Tag nach der Transduktion noch bei annĂ€hernd 30%.

Es gelang nach Transduktion der humanen Nierenzelllinie 293 mit HSV/AAV stabile
293-Einzelzellklone zu kultivieren und in 2 der ausgewÀhlten hochexprimierenden GFP+-Klone eine spezifische Integration in die AAVS1-site des humanen Chromosoms 19 darzustellen.

In humanen hĂ€matopoetischen CD34+-Stammzellen ließ sich eine Gentransferrate von 20% erzielen. Nach 10 Tagen lag die Transgenexpression zwar nur bei 1 bis 2% der Zellpopulation, jedoch verdreifachte sich die absolute Anzahl an GFP exprimierenden CD34+-Zellen aufgrund der Proliferation der CD34+-Zellen..
Neben den hÀmatopoetischen CD34+-Stammzellen wurden mesenchymale Stammzellen (MSZ) untersucht. Nach Transduktion der MSZ mit dem HSV/AAV-Hybridamplikonvektor HSV/AAV konnte eine hohe Transduktionsrate von ca. 90% mit einer niedrigen ZielzelltoxizitÀt erreicht werden. Nach 15 Tagen konnte nach Transduktion mit dem HSV/AAV noch eine Transgenexpression von 22% gezeigt werden, die bis zum 33. Tag bei 3 bis 4 % lag.

Zusammengefasst zeigten diese Daten, dass hybride HSV/AAV-Amplikonvektoren mindestens ĂŒber 2 Wochen anhaltende stabile Transgenexpression in hĂ€matopoetischen und mesenchymalen Stammzellen ermöglichen.

Kurzfassung auf Englisch: Human hematopoietic and mesenchymal stem cells are attractive target cells for gene therapy approaches. One of the major concerns of stable gene transfer into cells is malignant transformation mediated by random chromosomal integration. Among the integrating vectors the adenovirus associated viruses (AAV) alone are capable of site-specific integration. Recently, a novel HSV/AAV hybrid amplicon vector has been developed combining the unique features of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and AAV-type 2 vectors. The large packaging capacity of HSV amplicon vectors for the first time facilitates an assembly of the essential AAV elements for site-specific integration and the transgene on one vector in cis. Packaged in the herpesviral coat and tegument, the vectors are capable of high efficiency viral entry.

In this work preliminary transduction experiments with the HSV/AAV hybrid amplikon vector HSV/AAV expressing the green fluorescent protein located between the AAV-derived ITRs were performed first.

After transduction of different lymphohaematopoietic cell lines the highest gene transfer rate of approximately 70% was observed in the stem cell related human myeloid leukaemia cell line KG1a. In the human T-cell leukaemia line Jurkat a gene transfer rate of approximately 40% was achieved following transduction with the same vector dose. After transduction in both cell lines transgene expression was stable for 6 days and rapidly decreased afterwards. In comparison the transgene expression in hybrid amplicon vector-transduced 293 cells reached nearly 30% until 91 days after transduction. Cultivation of stable GFP+ 293 cell clones was achieved after transduction with the HSV/AAV hybrid amplicon vector HSV/AAV and a site-specific integration in the human chromosom 19 in 2 of the clones with the highest GFP-expression level was shown.

In the initial experiments in primary human hematopoietic CD34+ cells a gene transfer rate of 20% was obtained. 10 days after transduction a transgene expression of 1-2 % was achieved, however, the absolute cell count of GFP expressing CD34 cells tripled by proliferation of CD34 cells within one week.

In addition to CD34+ hematopoietic progenitor cells, mesenchymal stem cells were investigated a high transduction rate of approx. 90 could be achieved with a low cytotoxicity. A stable transgene expression of 22% was maintained for 15days.
Taken together, these data demonstrate, that HSV/AAV hybrid amplicon vectors mediate stable transgene expression for at least two weeks in human hematopoietic and mesenchymal stem cells.

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