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Die apoptotischen Endonukleasen Endonuklease G und Deoxyribonuklease IIalpha : Heterologe Expression, Reinigung und biochemische Charakterisierung

The apoptotic endonucleases Endonuclease G and Deoxyribonuclease IIalpha

Schäfer, Patrick


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-46364
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/4636/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Apoptose , Nukleasen , EndoG , DNase II , Sch√§fer
Freie Schlagwörter (Englisch): apoptosis , nucleases , EndoG , DNase II , Schafer
Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Institut f√ľr Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 15.04.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 25.04.2007
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Teilprojekte behandelt, die beide zur Aufklärung der strukturellen Natur der aktiven Spezies der apoptotischen Endonukleasen Endonuklease G (EndoG) und Desoxyribonuklease IIalpha (DNase IIalpha), beitragen sollten.
Aus S√§ugerzellen gewonnene bovine EndoG wurde zuvor bereits weitgehend biochemisch charakterisiert und f√ľr das Protein ein Homolgiemodell erstellt. Zu dessen Verifikation w√§re es notwendig, Kristallstruktur- oder NMR-spektroskopische Analysen durchzuf√ľhren. Um daf√ľr geeignete Proteinpr√§parationen herzustellen, sollte EndoG in E. coli √ľberexprimiert und gereinigt werden. Da EndoG dabei in inclusion bodies abgelagert wird, wurden in diesem Teil der Arbeit mehrere biochemische Strategien angewandt um aktive EndoG in l√∂slicher Form oder durch Renaturierung aus inclusion bodies zu gewinnen. Expression von EndoG als Fusion mit dem l√∂slichkeitsf√∂rdernden Protein NusA f√ľhrte zu dem Ergebnis, dass sowohl das Fusionsprotein, als auch EndoG nach Abspaltung von NusA durch Thrombin zwar l√∂slich, aber inaktiv waren. In anderen Ans√§tzen gelang es immerhin durch den Einsatz von Detergenzien in Verbindung mit dem k√ľnstlichen Chaperon beta-Cyclodextrin l√∂sliche EndoG aus inclusion bodies zu erhalten, aber keine Pr√§paration des Enzyms verf√ľgte √ľber zufrieden stellende Nukleaseaktivit√§t. Auch ein Matrix-basierter Rentaurierungsversuch unter Verwendung des iFOLDTM-Systems mit 92 verschiedenen, empirisch ermittelten Renaturierungspuffern brachte hier nicht den gew√ľnschten Erfolg.
Zur Charakterisierung des aktiven Zentrums von humaner lysosomaler DNase IIalpha sowie der Beantwortung der Frage, ob die aktive Spezies dieses Enzyms eine dimere oder monomere (pseudodimere) Struktur aufweist, wurde im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit nach erfolgreicher Etablierung eines Expressionssytems in S√§ugerzellen eine alanine scanning Mutagenese des Enzyms durchgef√ľhrt. Es wurden solche Aminos√§urereste gegen Alanin ausgetauscht, die in den vorgeschlagenen Modellen, zu den postulierten N- und C-terminalen PLD-Motiven HxK xn-N-xn-(E/Q/D) geh√∂ren. Die Ergebnisse des alanine scannings weisen stark darauf hin, da√ü das katalytische Zentrum der humanen DNase IIalpha von zwei PLD-Motiven gebildet wird, und die aktive Spezies folglich ein Monomer bzw. Pseudodimer ist. Gelfiltrationsanalysen sowie Coimmunopr√§zipitationsassays mit unterschiedlich Epitop-fusionierten DNase IIalpha-Varianten lieferten dar√ľber hinaus zus√§tzliche Hinweise auf eine pseudodimere Struktur der aktiven DNase IIalpha.
Kurzfassung auf Englisch: This thesis involved two projects that were to give insight into the structural nature of the apoptotic Endonucleases EndoG and DNase IIalpha.
Bovine EndoG that was gained from mammalian cells has already been extensively biochemicaly characterized and a homology model for the protein has been made. To verify the model it would be necessary to do crystal structure- or NMR-spectroscopic analyses. To produce Protein preparations that are suited for such investigations, EndoG was to be overexpressed in E. coli and then purified. As an overexpression of EndoG in E. coli leads to the protein being deposited in inclusion bodies, several biochemical strategies were utilized to overcome this problem and gain active EndoG in a soluble form. The expression of EndoG fused to the solubility enhancing protein NusA lead to the result that both, the fusionprotein as well as EndoG by itself, after cleaving off NusA with thrombin, were soluble but inactive. Another strategy, involved the use of a combination of detergents and an artificial chaperone, namely beta-Cyclodextrin and lead to preparations of soluble EndoG that lacked satisfactory nuclease activity. A matrix-based renaturing method (the iFOLDTM-System) which includes 92 empirically acquired refolding buffers also yielded soluble EndoG in an inactive form.
The second part of the thesis, dealt with the human lysosomal DNase IIalpha. After having established an expression/purification system in mammalian cells an alanine scanning mutagenesis was performed. Those amino acid residues that, according to presented models, belong to the N- and C-terminal PLD-motifs HxK xn-N-xn-(E/Q/D) were exchanged to alanine. Then the active site of the enzyme was characterized and the question whether the active DNase IIalpha is a monomer (pseudodimer) or a dimer was addressed. The results of the alanine scanning strongly support the theory that the DNase IIalpha is a pseudodimer with two PLD motifs in one polypeptide chain that together form an active site. Additionally gelfiltration- and coimmunoprecipitation-assays using different epitope tags were done to investigate the monomer-dimer status of DNase IIalpha. The resulting data also support the theory that the DNase IIalpha is a pseudodimer.
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