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DNA-Bindung und -Spaltung durch den DNA-Fragmentierungs-Faktor (DFF)

Korn, Christian


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-23141
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2005/2314/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Apoptose , Nuklease , DNase , DNA-Fragmentierung , Protein-DNA-Interaktion
Universität Justus-Liebig-Universit├Ąt Gie├čen
Institut: Institut f├╝r Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der m├╝ndlichen Pr├╝fung: 17.04.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 15.08.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Der DNA-Fragmentierungs-Faktor(DFF)spielt eine wesentliche Rolle bei der DNA-Fragmentierung im Zuge der Apoptose. Er besteht aus den beiden Unter-
einheiten DFF40 (CAD) und DFF45 (ICAD), wobei erstgenannte nukleolytische Funktion aus├╝bt und DFF45 (ICAD) spezifischer Faltungshelfer und Inhibitor der Nuklease ist.


Im ersten Teil der Arbeit wird ein Expressions- und Reinigungssystem f├╝r DFF vorgestellt. Mit dem Zwei-Plasmid-Expressions-System pACET-DFF45/ pET-DUET-His-CAD wurde DFF rekombinant in hohen Mengen in E. coli produziert. Der affinit├Ątschromatographischen Reinigung ├╝ber Ni-NTA-Agarose folgte ein zweiter Reinigungsschritt zur Entfernung von Proteinkontaminationen und chromosomaler Bakterien-DNA ├╝ber Anionen- austauschchromatographie. ├ťber Ultrafiltrationseinheiten konzentriert wurde aus 10 l Fermentern ca. 50 mg DFF pr├Ąpariert. Dieser Komplex wurde f├╝r biochemische Studien, z. B. der Untersuchung der DNA-Bindung von DFF, und auch in strukturellen Untersuchungen eingesetzt.


Ein Ziel dieser Arbeit lag in der biochemischen Charakterisierung des aktiven Zentrums von DFF40 (CAD). Zur Identifizierung katalytisch relevanter Aminos├Ąurereste trug die ortsgerichtete Mutagenese bei. F├╝r Histidinreste und Lysinreste konnte in der vorliegenden Arbeit eine
funktionelle Relevanz ermittelt werden, was durch chemische Modifizierungsexperimente unterst├╝tzt wurde (Meiss et al., 2001, Korn et al., 2002). Eine eindeutige funktionelle Zuordnung gelang f├╝r His263 als allgemeine Base im Mechanismus der Phosphodiesterspaltung. F├╝r His308 wurde ├╝ber eine Rolle als allgemeine S├Ąure spekuliert (Meiss et al., 2001, Korn et al., 2002). Die tats├Ąchliche Funktion als wichtigster Rest f├╝r die Koordination des zweiwertigen Metallions Mg2+ konnte f├╝r His308 nach einem Alignment mit ColE9 DNase und T4 Endonuklease VII und weiteren Mutationsanalysen sp├Ąter nach dem Erhalt von Strukturinformationen
zugeordnet werden. Mit diesen Informationen, experimentell bewiesen, konnte CAD der Superfamilie der ββα-Me-finger-Nukleasen zugeordnet werden, ein Modell des aktiven Zentrums der Nuklease aufgestellt und der Mechanismus der Phosphodiesterspaltung dargestellt werden (Scholz et al., 2003).


Mit dem getrennt induzierbaren Expressionssystem pLK-HisFlag-ICAD-S/ pGEX2T-CADWT war eine getrennte Induktion der Expression der beiden Gene ICAD-S und GST-CADWT in E. coli zu erreichen. Der Komplex aus GST-CAD/ ICAD-S wurde anschlie├čend affinit├Ątschromatographisch gereinigt und zur Untersuchung der chaperonen Aktitvit├Ąt von ICAD-S eingesetzt. Die aus diesem Komplex mittels Caspase-3 freigesetzte Nuklease zeigte in DNA-Spaltexperimenten eine nukleolytische Aktivit├Ąt, wodurch die chaperone Eigenschaft von ICAD-S nachgewiesen werden konnte. Gegen├╝ber ICAD-L ist die chaperone Aktivit├Ąt der k├╝rzeren Splicevariante allerdings etwa 50 mal weniger effektiv (Scholz et al., 2002).


Der Nachweis der DNA-Bindung ist bei unspezifischen Nukleasen und DNase/Inhibitor-Komplexen sehr ungew├Âhnlich. Im Laufe dieser Arbeit konnte mit DFF sowohl f├╝r den Komplex als auch f├╝r die aktivierte Nuklease DFF40 (CAD) DNA-Bindung gezeigt werden. DNA-Bindung von DFF stellt einen neuen, bislang unbekannten Mechanismus der Nukleaseinhibition dar, bei dem zwar die DNA-Spaltung verhindert, aber die DNA-Bindung zugelassen wird. Au├čerdem wurde eine Stimulation der Aktivit├Ąt von DFF40 (CAD) durch Aktivierung
aus einem DNA-gebundenen DFF-Komplex mit Plasmid-DNA und auch mit isolierten Kernen festgestellt. Diese Tatsache und die beobachtete Assoziation von DFF mit Chromatin implizieren einen Mechanismus, bei dem die Aktivierung von DFF w├Ąhrend der Apoptose im Zellkern in DNA-gebundener Form stattfinden kann (Korn und Scholz et al., 2005).
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