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Entwicklung eines programmierbaren Restriktionsenzyms

Eisenschmidt, Kristin


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-20041
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2005/2004/

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Zugriffsbeschr├Ąnkung: NoDNB
Freie Schlagwörter (Deutsch): adressierte Spaltung , Restriktionsendonuklease , triple helix
Universität Justus-Liebig-Universit├Ąt Gie├čen
Institut: Institut f├╝r Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der m├╝ndlichen Pr├╝fung: 03.02.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 10.02.2005
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit sollte die Spezifit├Ąt der Restriktionsendonuklease scPvuII durch Kopplung mit der Spezifit├Ąt eines TFOs (triple-helix forming Oligonukletids) erweitert werden. Hierf├╝r wurde zuerst die scPvuIIH6G4C-Variante exprimiert und ├╝ber Affinit├Ątschromatographie gereinigt. Die DNA-Bindungseigenschaften dieser Variante wurden anschlie├čend mit und ohne den Kofaktor Mg2+ mit Hilfe von Fluoreszenz-Anisotropie-Messung bestimmt. Anschlie├čend wurde ein TFO mit dem C-terminalen Ende der scPvuIIH6G4C-Variante unter Verwendung des bifunktionalen Crosslinkers GMBS kovalent verkn├╝pft. Dessen mit N-Hydroxysuccimid aktivierte Carboxylatgruppe reagiert mit der NH2-Gruppe des TFOs unter Ausbildung einer Amidbindung. Nach Entfernung des ├╝bersch├╝ssigen Crosslinkers durch Gelfiltration konnte das TFO-GMBS Konstrukt in einer zweiten Reaktion mit dem C-terminalen Cystein des Proteins ├╝ber eine Thioetherbindung kovalent verbunden werden. Von dem so hergestellten TFO-scPvuII-Heterokonjugat musste anschlie├čend ungekoppeltes, freies scPvuII abgetrennt werden, da dieses mit der adressierten Spaltung des TFO-scPvuII Konstruktes durch nicht-adressierte Spaltung interferieren w├╝rde. Diese Abtrennung erfolgte mittels Anionenaustauschchromatographie. Die nahezu 100 %ige Reinheit des gereinigten TFO-scPvuII-Heterokonjugates konnte ├╝ber SDS-PAGE gezeigt werden. Parallel dazu wurden die Bindungseigenschaften verschiedener TFOs hinsichtlich ihrer triple-helix-Bildung mit Hilfe verschiedener Untersuchungsmethoden, z.B. 'electrophoretic mobility shift assay', 'cleavage protection assay' und 'circular dichroism', charakterisiert und f├╝r die Anwendung unter physiologischen Bedingungen optimiert. Nachdem die optimalen Bedingungen zur Ausbildung einer triple-helix gefunden worden waren und das TFO-scPvuII-Heterokonjugat gereinigt vorlag, konnten Experimente zur adressierten Spaltung von PCR-Substraten durchgef├╝hrt werden, wobei die Mg2+-Konzentration, die Linker-L├Ąnge des Heterokonjugates, der Abstand zwischen adressierter PvuII-Spaltstelle und triple-helix Bindungsstelle und die Ionenst├Ąrke variiert wurden. In diesen Experimenten wurde eine optimale Mg2+-Konzentration von 1,25 mM ohne NaCl bzw. 2,5 mM mit 100 mM NaCl, sowie ein Optimum der Linker-L├Ąnge von 12 Methylengruppen (C12-Linker) und ein Abstand von 9 bp zwischen TFS und der adressierten Spaltstelle gefunden. Unter diesen optimalen Bedingungen konnten Spaltpr├Ąferenzen im dreistelligen Bereich zwischen adressierten und nicht-adressierten PvuII-Spaltstellen gemessen werden. Spaltexperimente mit makromolekularen Substraten (supercoil und linearer Plasmid-DNA), sowie in Kompetition mit einem hohen ├ťberschuss an λ-DNA best├Ątigten die hohe Pr├Ąferenz f├╝r adressierte Spaltstellen durch das Konjugat.
Als erste Experimente f├╝r in vivo Applikationen wurden Kernlokalisationsexperimente durchgef├╝hrt. Hier konnte gezeigt werden, dass transient exprimierte scPvuII-Varianten mit einem NLS in den Nukleus transportiert werden k├Ânnen. Diese Ergebnisse sollen sp├Ąter auf das TFO-scPvuII-Heterokonjugat erweitert werden, wenn das Konjugat f├╝r adressierte Spaltexperimente in vivo angewendet werden soll.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein TFO-Restriktionsendonuklease-Heterokonjugat entwickelt, das gezielt und hochspezifisch zur adressierten Spaltung von DNA in vitro eingesetzt werden kann. Dabei hat sich herausgestellt, dass die Mg2+-Konzentration, die Salzkonzentration, die L├Ąnge des Linkers, der TFO und Protein verbindet, und der Abstand zwischen triple-helix Bindungsstelle und PvuII-Spaltstelle einen wesentlichen Einfluss auf die Erreichbarkeit der zur triple-helix Bindungsstelle direkt benachbarten PvuII-Schnittstelle und damit auf die Spaltaktivit├Ąt des Konjugates haben. Dieses Heterokonjugat hat aufgrund seiner hohen Spezifit├Ąt und der flexiblen Kombinierbarkeit verschiedener TFOs mit verschiedenen Restriktionsenzymen enormes therapeutisches Potential und kann nun f├╝r in vivo Applikationen weiter charakterisiert werden.
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