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Comparative studies of recombinant oncolytic viruses for the treatment of CD133-positive tumors

Schadel, Dina


Originalveröffentlichung: (2020) Gießen : DVG Service GmbH
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.962 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-151098
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2020/15109/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Onkolytische Viren , Glioblastoma Multiforme , HepatozellulĂ€res Karzinom , Krebsstammzellen , CD133
Freie Schlagwörter (Englisch): Oncolytic Viruses , Glioblastoma Multiforme , Hepatocellular Carcinoma , Cancer Stem Cells , CD133
Universität Justus-Liebig-UniversitĂ€t Gießen
Institut: Institut fĂŒr Virologie ; Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Abteilung "Molekulare Biotechnologie und Gentherapie"
Fachgebiet 1: VeterinÀrmedizin
Fachgebiet 2: Externe Einrichtungen
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 978-3-86345-534-7
Sprache: Englisch
Tag der mĂŒndlichen PrĂŒfung: 04.07.2019
Erstellungsjahr: 2020
Publikationsdatum: 24.06.2020
Kurzfassung auf Englisch: Cancer stem cells (CSCs) have been found to mark the tumorigenic cell population within various malignancies. Among many putative markers, prominin-1 (also known as CD133) is frequently used to identify and isolate CSCs of the above mentioned malignancies. To date, there is no effective approach to reduce the rate of tumor recurrence ascribed to CSCs. Thus, targeting of CSCs is critical to achieve long-term success in cancer treatment. One strategy to selectively destroy CSCs is the precise targeting of this cell subset via targeted oncolytic viruses (OVs). One of the lead oncolytic agents in ongoing clinical trials is oncolytic measles virus (MV) based on the safe vaccine strain Edmonston B (Edm) that induced complete remission after one intravenous (i.v.) administration of 1E+11 infectious virus in one patient suffering from disseminated multiple myeloma (Russell et al., 2014). MV-Edm uses the ubiquitous membrane cofactor protein (MCP, also known as CD46) for cell entry, which is overexpressed on tumor cells. To restrict virus replication to tumor cells, the glycoprotein (gp) complex of MV can be engineered to redirect receptor usage to cell surface proteins of choice. Based on this approach, a CD133-retargeted MV (MV-CD133) was generated prior to this work through fusion of a CD133-specific single-chain antibody fragment (scFv) as targeting domain to the receptor attachment protein hemagglutinin (H) ablated for its natural receptors CD46, signal lymphocyte-activation molecule (SLAM) and nectin-4 (also known as Poliovirus receptor-related 4, PVRL4). MV-CD133 exhibited a stronger oncolytic activity on CD133-positive tumors compared to untargeted parental MVs using CD46 for cell entry (Bach and Abel et al., 2013).
As tumor regression was incomplete, this thesis pursued strategies to enhance the oncolytic activity of MV-CD133 without having to compromise on safety. For that purpose, arming with the prodrug 5-fluorocytosine (5-FC) converting suicide gene supercytosinedeaminase (SCD), or with P/V/C genes from wild-type MVs, or receptor extension through omission of blinding mutations were pursued. Additionally, a chimeric vesicular stomatitis / measles virus (VSV-MV), in which the gp VSV-G was replaced by the MV-H and MV-F gp fused to a CD133-scFv was examined. The viruses were analyzed for their oncolytic activity in vitro and by in vivo models of the hepatocellular carcinoma (HCC) cell line HuH7 and of the primary glioma sphere cells NCH644 using NOD/Scid (Nonobese diabetic/severe combined immunodefiency) mice known to be devoid of human CD46 expression. All viruses were found to be highly selective for CD133-positive cells as demonstrated by infection of receptor transgenic chinese hamster ovary (CHO) cells. As CD133 is also expressed on early hematopoietic progenitor cells, the proliferative and differentiation capacity of infected human hematopoietic stem cells (HSCs) was evaluated using clonal outgrowth assays. None of the CD133-retargeted viruses impaired the hematopoietic capabilities of HSCs. On HuH7 cells, VSV-MV chimeric viruses yielded substantially higher titers than their parental viruses. VSV-CD133 and MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) achieved the most rapid and efficient cytotoxicity on HuH7 cells. In a subcutaneous HuH7 model, VSV-CD133 most efficiently slowed down tumor growth resulting in a prolonged survival of mice treated intratumorally (i.t.) and i.v.. VSV-CD133 infected a more than 1E+04-fold larger area of the tumor than MV-CD133 did in the same period. In killing assays on NCH644 cells, all viruses killed cells dose-dependently. While MV-CD46/CD133 and MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) caused a continuous decline in cell numbers over time even at low multiplicity of infection (MOI), VSV-MV chimeric viruses were only able to reduce cell viability within in the first 48 h after infection. In an orthotopic NCH644 model, MV-CD46/CD133 and MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) were most effective in prolonging survival compared to mock-treated mice. Ex vivo sphere formation assays revealed that cells of those tumors explanted at termination showed impaired stemness properties compared to those of the other viruses. By contrast, VSV-CD133 led to severe neurotoxic symptoms within 10 days after infection in tumor bearing mice. The neurotoxicity was also apparent in tumor-naĂŻve mice that were intracerebrally (i.c.) injected with VSV-CD133 as well as upon injection with nontargeted VSV-MV suggesting that deceased mice must have succumbed to another genesis than that of i.t. virus amplification or the scFv themselves. The role of the yet un-known neuronal MV receptor or a membrane fusion process that occurred independently from a contact with H need to be tested as potential causatives.
Kurzfassung auf Deutsch: Krebsstammzellen (engl. cancer stem cells, CSCs) definieren die tumorigene Zellpopulation in verschiedenen Tumoren. Ein vermeintlicher Marker fĂŒr die Identifizerung und Isolierung von CSC ist Prominin-1 (auch bekannt als CD133). Bislang gibt es keinen wirksamen Ansatz, um die Tumorrezidiv-Rate, die den CSC zugeschrieben wird, zu senken. Daher ist die gezielte Zerstörung von CSC bedeutend fĂŒr einen langfristigen Therapieerfolg. Eine Strategie zur selektiven Zerstörung von CSC ist das prĂ€zise targeting dieser Zellen mittels onkolytischer Viren (OVs). Eines der fĂŒhrenden OV in laufenden klinischen Studien ist ein onkolytisches Masernvirus (MV) auf der Grundlage des Impfstoffstammes Edmonston B (Edm), das nach einer intravenös (i.v.) verabreichten Dosis von 1E+11 infektiösen Einheiten eine vollstĂ€ndige Remission eines disseminierten multiplen Myeloms induzierte (Russell et al., 2014). MV-Edm nutzt das ubiquitĂ€re CD46, das auf Tumorzellen ĂŒberexprimiert wird, fĂŒr den Zelleintritt. Um die Virusreplikation auf Tumorzellen zu begrenzen, kann der Glykoprotein-Komplex von MV so konstruiert werden, dass ein ZelloberflĂ€chenprotein der Wahl fĂŒr den Zelleintritt verwendet wird. Basierend auf diesem Ansatz wurde zuvor durch Fusion eines CD133-spezifischen Einzelketten-Antikörperfragments (scFvs) als Targeting-DomĂ€ne an das Rezeptor-bindende HĂ€magglutinin (H) ein CD133-spezifisches MV (MV-CD133) erzeugt, dessen natĂŒrliche Rezeptornutzung durch vier spezifische Punktmutationen unterbunden wurde. MV-CD133 zeigte eine stĂ€rkere onkolytische AktivitĂ€t bei CD133-positiven Tumoren im Vergleich zu ungezielten MV, die CD46 fĂŒr den Zelleintritt verwenden (Bach und Abel et al., 2013).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es ohne Einbußen an Sicherheit die onkolytischen AktivitĂ€t von MV-CD133 zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde MV-CD133 mit dem induzierbaren zytotoxischen Transgen Super-Cytosindeaminase (SCD) oder mit dem P/V/C-Gen des MV Wildtyps ausgestattet. Zudem wurde durch Weglassen der blinding mutations ein CD133-spezifisches MV mit einer breiteren Rezeptorausnutzung entwickelt (MV-CD46/CD133). ZusĂ€tzlich wurde ein chimĂ€res vesikulĂ€res Stomatitis/Masernvirus (VSV-MV) untersucht, bei dem das VSV-Glykoprotein G durch die an CD133-scFv fusionierten MV-Glykoproteine ersetzt wurde. Die onkolytische AktivitĂ€t der Viren wurde auf der hepatozellulĂ€ren Karzinom (HCC) Zelllinie HuH7 und den primĂ€ren Gliomzellen NCH644 in vitro sowie in vivo unter Verwendung von NOD/Scid (Nonobese diabetic/severe combined immunodefiency) MĂ€usen analysiert, die keine humane CD46-Expression aufweisen. Alle Viren infizierten selektiv CD133-positive Zellen, was durch die Infektion von Rezeptor-transgenen chinesischen Hamster-Eierstockzellen (CHO) gezeigt wurde. Obwohl CD133 auch auf frĂŒhen hĂ€matopoetischen VorlĂ€uferzellen exprimiert wird, wurden die Stammzell-Eigenschaften infizierter humaner hĂ€matopoetischer Stammzellen (engl. hematopoietic stem cells, HSCs) durch keines der CD133-spezifischen Viren beeintrĂ€chtigt. Auf HuH7 Zellen ließen sich mit den VSV-MV Hybridviren wesentlich höhere Titer als mit den jeweiligen parentalen Viren erzeugen, wobei VSV-CD133 und MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) die schnellste und effizienteste Zytolyse induzierten. In einem subkutanen HuH7-Modell verlangsamte VSV-CD133 das Tumorwachstum am effizientesten und fĂŒhrte zu einem verlĂ€ngerten Überleben der MĂ€use, die intratumoral (i.t.) bzw. i.v. therapiert wurden. VSV-CD133 infizierte eine 1E+04-fach grĂ¶ĂŸere FlĂ€che des Tumors als MV-CD133 in demselben Zeitraum. Auf NCH644-Zellen töteten alle Viren die Zellen dosisabhĂ€ngig ab. WĂ€hrend MV-CD46/CD133 und MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) selbst bei geringer multiplicity of infection (MOI) zu einem kontinuierlichen RĂŒckgang der Zellzahlen im Laufe der Zeit fĂŒhrten, konnten VSV-MV Hybridviren die ZellvitalitĂ€t nur innerhalb der ersten 48 Stunden nach Infektion reduzieren. In einem orthotopen NCH644 Modell fĂŒhrte die Infektion der Tumore mit jeweils MV-CD46/CD133 und MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) zu den lĂ€ngsten Überlebenszeiten im Vergleich zu Kontroll-MĂ€usen (mock). Ex vivo “sphere formation assays” zeigten, dass explantierte Tumorzellen, die mit den o.g. Viren infiziert wurden, im Vergleich zu den Tumorzellen der restlichen Therapiegruppen ihre Stammzell-Eigenschaften verringert oder sogar verloren hatten. Im Gegensatz dazu fĂŒhrte VSV-CD133 innerhalb von 10 Tagen nach der Infektion bei tumortragenden MĂ€usen zu schweren neurotoxischen Symptomen. Die NeurotoxizitĂ€t zeigte sich auch bei mit VSV-CD133 intracerebral (i.c.) injizierten nicht-Tumor tragenden MĂ€usen sowie bei der Injektion mit ungerichtetem VSV-MV, was darauf hindeutet, dass diese MĂ€use aus anderen GrĂŒnden als eine i.t. Virusamplifikation oder eine scFv-vermittelte ToxizitĂ€t eine gesteigerte LetalitĂ€t aufwiesen. Die Rolle des noch unbekannten neuronalen MV-Rezeptors oder eines HĂ€magglutinin-unabhĂ€ngigen Membranfusionsprozesses, mĂŒssen als mögliche Ursachen getestet werden.
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