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Untersuchungen zur Biogenese von C8-Aromastoffen in Lentinula edodes (Shiitake)

Heuger, Alexander Heinz


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-150651
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2020/15065/


Universität Justus-Liebig-UniversitĂ€t Gießen
Institut: Institut fĂŒr Lebensmittelchemie und Lebensmittelbiotechnologie
Fachgebiet: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mĂŒndlichen PrĂŒfung: 17.01.2020
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 01.04.2020
Kurzfassung auf Deutsch: Ein biotechnologischer Ansatz zur Produktion von Aromaextrakten mit der GeruchsqualitĂ€t „pilzig“ wurde auf Basis der submersen Kultivierung von Lentinula edodes (Trivialname Shiitake) und anschließendem Aufschluss des Myzels entwickelt. Die Bildung von Aromastoffen wurde anhand der Gehalte des SchlĂŒsselaromastoffs Oct 1 en 3 ol in den Homogenaten des Myzels beurteilt. Als Parameter fĂŒr das Wachstum des Pilzes wurde die Trockenmasse bestimmt. Das Medium der Hauptkultur wurde schrittweise optimiert, um die an der Aromabildung beteiligten Enzyme zu induzieren, und zudem vereinfacht, um Kosten einzusparen. ZusĂ€tzlich wurde die Dauer der Hauptkultur unter Steigerung der Ausbeute an Oct 1 en 3 ol um zwei auf acht Tage verkĂŒrzt. Die Bildung der Aromastoffe nach Aufschluss des Myzels wurde untersucht und der Prozess optimiert. Insbesondere der Einfluss des precursors LinolsĂ€ure sowie die Auswirkung der Inkubationszeit der Homogenate wurden ermittelt. Der Zusatz von LinolsĂ€ure sowie eine Inkubationszeit von bis zu 30 min bewirkte eine signifikante Steigerung der Gehalte an Oct 1 en 3 ol. Unter optimalen Bedingungen wurden mit etwa 6.200 ”g Oct 1 en 3 ol g-1 Trockenmasse Myzel bzw. 35 mg Oct 1 en 3 ol L-1 Transformationsansatz die höchsten bislang fĂŒr submers kultivierte Basidiomyceten berichteten Gehalte erzielt. Das gebildete Oct 1 en 3 ol weist einen EnantiomerenĂŒberschuss (% ee) von ĂŒber 90% bis zu 93% zugunsten des erwĂŒnschten R-(-)-Enantiomers auf.
Das Aromaprofil des submers kultivierten Myzels von L. edodes wurde vergleichend unter enzyminhibierenden und enzymaktivierenden Bedingungen untersucht. Dazu wurden mittels FlĂŒssig-flĂŒssig-Extraktion (LLE) mit anschließender solvent-assisted flavour evaporation (SAFE) sowie durch headspace solid-phase microextraction (HS SPME) Aromaextrakte aus homogenisiertem Myzel gewonnen. Die Identifizierung der geruchsaktiven Stoffe in den Extrakten erfolgte mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O) und Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC MS). Das Aromaprofil des unter enzymaktivierenden Bedingungen aufgeschlossenen Myzels war geprĂ€gt durch C8-Aromastoffe und S haltige Verbindungen.
Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung und Isolierung der Hydroperoxidlyase (HPL), welche die Spaltung von 10-Hydroperoxy-octadeca-8(E),12(Z)-diensĂ€ure (10 HPOD) zu Oct 1 en 3 ol und 10 Oxo-dec 8(E) ensĂ€ure katalysiert. Als Vorarbeit wurde 10-HPOD ĂŒber eine Photooxygenierung von LinolsĂ€ure synthetisiert und mittels DĂŒnnschicht-chromatographie, NMR sowie nach Derivatisierung mittels GC-MS analysiert. Zudem wurde die Bildung von 10-HPOD in submers kultiviertem Myzel nachgewiesen, was den aus Fruchtkörpern von Basidiomyceten bekannten Biosyntheseweg von Oct 1 en 3 ol bestĂ€tigt.
Ein spezifischer Assay fĂŒr die HPL-AktivitĂ€t wurde durch Bestimmung des Produktes Oct 1 en 3 ol mittels HS-SPME-enantio-GC-MS entwickelt und erlaubte anhand des EnantiomerenverhĂ€ltnisses und geeigneter Kontrollen die Unterscheidung zwischen enzymatischer Umsetzung und spontanem Zerfall des Substrates 10 HPOD. Der Assay wurde fĂŒr die aktivitĂ€tsgeleitete Isolierung der HPL eingesetzt.
Im Überstand der Submerskultur von L. edodes wurde keine HPL-AktivitĂ€t festgestellt und somit eine Sekretion des gesuchten Enzyms ausgeschlossen. Daher erfolgte die Reinigung aus Myzel und Fruchtkörpern. Durch mechanischen ZellÂŹaufschluss wurde das Enzym freigesetzt und das Homogenat mittels Ultra-zentrifugation separiert. Die HPL-AktivitĂ€t wurde im Pellet (Mikrosomenfraktion), aber nicht im Überstand der Ultrazentrifugation nachgewiesen. Folglich handelt es sich nicht um ein lösliches Protein, sondern vermutlich um ein Membranprotein. Das Enzym wurde unter Verwendung des nichtionischen Detergens Saccharosemonolaurat (SML) solubilisiert. FĂŒr die Reinigung der HPL aus dem Extrakt mittels Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) erwiesen sich die Anionenaustauschchromatographie sowie die Gelfiltrationschromatographie (SEC) als geeignete Trenntechniken. FĂŒr das Enzym mit HPL-AktivitĂ€t wurde mittels Gelfiltrationschromatographie ein apparentes Molekulargewicht im Bereich von 42 kDa bis 66 kDa ermittelt. Als finale Reinigungsstrategie wurden die SEC und Ionenaustauschchromatographie kombiniert. Nach der Reinigung wurde geringe HPL-AktivitĂ€t nachgewiesen und mittels SDS-PAGE mit kolloidaler Coomassie-FĂ€rbung wurden zwei Proteinbanden mit Molekulargewichten von 62 kDa bzw. 55 kDa detektiert.
Die Banden wurden Partnern zur Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF-MS sowie zur de novo-Sequenzierung nach tryptischem Verdau mittels ESI-MS/MS ĂŒbergeben. Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Proteinanalytik fĂŒhrten jedoch weder zu Übereinstimmungen mit bekannten Proteinen noch wurden mit den generierten Sequenzen Treffer in den verfĂŒgbaren Basidiomyceten-Genomen erhalten. Die erfolgreiche Messung von HPL-AktivitĂ€t in der gereinigten Proteinlösung zeigt jedoch die Eignung der Reinigungsstrategie.

Kurzfassung auf Englisch: A biotechnological approach for the production of flavouring preparations with the odour quality “mushroom” was developed based on the submerged cultivation of Lentinula edodes (shiitake) with subsequent cell disruption. The formation of aroma compounds in the homogenates of the mycelia was evaluated using the content of the character impact compound oct 1 en 3 ol as an indicator. Dry mass was determined as a parameter for judging the growth of the fungus. The main culture medium was optimised stepwise in order to induce the enzymes involved in the formation of C8 compounds and, moreover, simplified to save costs. Additionally, the duration of the main culture was shortened by two days to eight days while increasing the yield of oct 1 en 3 ol. The formation of aroma compounds after cell disruption was investigated and the process was optimised. Especially the influence of the precursor linoleic acid and the effect of the duration of the incubation of the homogenates were determined. The addition of linoleic acid as well as an incubation time of up to 30 min resulted in a significant increase of the oct 1 en 3 ol contents. Under optimised conditions, levels of up to 6,200 ”g oct 1 en 3 ol per g mycelium (dry mass) or 35 mg oct 1 en 3 ol per L transformation batch, respectively, were obtained. These are the highest yields reported so far for basidiomycetes in submerged culture. The oct 1 en 3 ol formed in the process showed a high enantiomeric excess (% ee) of >90% up to 93% in favour of the desired R ( ) enantiomer.
The flavour profile of the submerged cultivated mycelium of L. edodes was analysed comparing extracts obtained under enzyme inhibiting and enzyme activating conditions, respectively. Therefore, aroma extracts were obtained from the homogenised mycelia by means of liquid-liquid extraction (LLE) followed by the solvent-assisted flavour evaporation (SAFE) technique as well as headspace solid-phase microextraction (HS-SPME). The identification of odour-active compounds in the extracts was accomplished applying GC-olfactometry and GC-MS. The aroma profile of mycelia, which were homogenised under enzyme activating conditions, was composed of C8 volatiles and sulfur-containing aroma compounds.
A second focus of this work was on the analysis and isolation of the hydroperoxide lyase (HPL) catalysing the cleavage of 10-hydroperoxy-octadeca 8(E),12(Z) dienoic acid (10-HPOD) to yield oct 1 en 3 ol and 10 oxo-dec 8(E) enoic acid. As a prerequisite, 10-HPOD was synthesised using photooxygenation of linoleic acid and analysed by means of thin layer chromatography, NMR, and, after derivatisation, GC-MS. Furthermore, the formation of 10 HPOD was observed in mycelia from submerged culture, which confirms the biosynthetic pathway for oct 1 en 3 ol known for fruiting bodies of basidiomycetes.
A specific assay for the HPL activity was developed measuring the product oct 1 en 3 ol using HS-SPME-enantio-GC-MS and employment of appropriate controls allowed for differentiation of enzymatic conversion and spontaneous decomposition of the substrate 10-HPOD based on the enantiomeric ratio. The assay was applied for the activity-guided purification of the HPL.
No HPL activity was detected in the culture broth of submerged cultures of L. edodes; thus a secretion of the sought-after enzyme can be excluded. Consequentially, mycelia and fruiting bodies were selected as starting materials for the isolation. Mechanical cell disruption liberated the enzyme and the homogenate was separated by means of ultracentrifuging. The HPL activity was detected in the pellet (microsomal fraction) but not in the supernatant of the ultracentrifuging. Hence, the HPL is not a soluble protein but presumably a membrane protein. For the further purification process, the enzyme was solubilised using the non-ionic detergent saccharose monolaurate (SML). Anion exchange chromatography and gel filtration chromatography (SEC) proved to be suitable separation techniques for the purification of the HPL from the extract via fast protein liquid chromatography (FPLC). An apparent molecular weight of 42 kDa to 66 kDa was determined by means of gel filtration chromatography for the enzyme exhibiting HPL activity. In the final purification strategy, SEC and anion exchange chromatography steps were combined. After purification, slight HPL activity was demonstrated and SDS-PAGE with colloidal Coomassie staining detected two protein bands with molecular weights of 62 kDa and 55 kDa, respectively.
The protein bands were handed to partners for protein identification by means of MALDI-TOF-MS and for de novo sequencing applying ESI-MS/MS after tryptic digest. The results of the mass spectrometric analyses neither led to matches with known proteins nor the generated sequences yielded hits in the available genomes of basidiomycetes. However, the successful measurement of HPL activity in the purified protein solution proved the applicability of the purification strategy.
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