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Establishment and Characterisation of a Clinically Relevant Metaphyseal Fracture Model in the Distal Femur of Skeletally Matured Sheep

Alagboso, Francisca Ijeoma


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-149164
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14916/

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Freie Schlagwörter (Englisch): Bone healing , adult sheep , metaphyseal fracture , locking plate , biomechanics , microstructure , ultrastructure
Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Labor f√ľr Experimentelle Unfallchirurgie
Fachgebiet: Medizin fach√ľbergreifend
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 03.10.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 06.11.2019
Kurzfassung auf Englisch: Despite the high incidence of metaphyseal bone fractures in patients, the cellular and molecular mechanisms underlying the healing process of metaphyseal fractures are still poorly understood due to the unavailability of suitable experimental animal models. The intention of the current work was to establish a novel clinically relevant large animal model for metaphyseal bone healing in the distal femur of skeletally matured sheep. In contrast to commonly used partial osteotomy models, this model employed a complete wedge-shaped osteotomy at the metaphysis. The osteotomy was stabilised internally with a customised anatomical locking titanium plate that allowed immediate postoperative full weight bearing. Bone healing was evaluated at 12 weeks post-fracture relative to the unoperated contralateral femur. No plate breakage or secondary fracture was recorded in the animals. Histological and micro-computed tomography results revealed an increased amount of mineralised and dense trabeculae with rich bone marrow. The new trabeculae healed via direct intramembranous ossification without visible callus and cartilaginous tissue formation. Functional morphological analysis of the osteocyte-lacuna revealed regularly arranged spherically shaped osteocytes-lacunae along with the canaliculi system. The biomechanical test revealed a comparable stiffness in both operated and unoperated femurs. However, the stiffness at their cortical regions was two-fold more than in their trabecular regions. Histomorphometric assessment of two major bone matrix enzymes: ALP (osteoblast marker) and TRAP (osteoclast marker) revealed a significantly higher ALP activity in the operated femur. Bone remodelling was evident by the expressed bone formation markers (COL1A1, ALP, BGLAP, BMP2, ASMA, OPG) and bone resorption markers (RANKL, CTSK) as revealed by quantitative PCR and immunohistochemistry. Bone surface biochemical analysis using time-of-flight secondary ion mass spectrometry showed high, and a homogeneously distributed calcium and collagenous components. Ultrastructural imaging of the new trabeculae revealed a characteristic parallel arrangement of the collagen fibrils uniformly mineralised by the dense mineral substance. Active osteoblasts were characterised by their plump cuboidal-shape, abundant rough endoplasmic reticulum, and a distinct Golgi apparatus whereas active osteoclasts were characterised by their large size, multiple nuclei and a ruffled border. The ultrastructure of the osteocytes varied according to the mineralisation level. The matured star-shaped osteocytes embedded inside the fully mineralised bone whereas young osteocytes embedded within the osteoid or partially mineralised bone areas. In conclusion, this newly established metaphyseal fracture model is of interest to study bone healing and treatment options for the enhancement of metaphyseal fractures.
Kurzfassung auf Deutsch: Ungeachtet einer hohen Inzidenz f√ľr metaphys√§re Frakturen beim Menschen sind die dem Heilungsprozess unterliegenden zellul√§ren und molekularen Mechanismen immer noch unzureichend bekannt, was in erster Linie durch das Fehlen klinisch relevanter Tiermodelle zu begr√ľnden ist. In der vorliegenden Studie wurde ein neuartiges, klinisch relevantes Gro√ütier-Modell f√ľr die metaphys√§re Knochenheilung im distalen Femur ausgewachsener Schafe etabliert. Im Gegensatz zu normalerweise genutzten partiellen Osteotomien realisierte dieses Modell eine durchgehende keilf√∂rmige Osteotomie im Bereich der Metaphyse. Die Osteotomie wurde durch eine anatomische winkelstablie Platte stabilisiert, welche postoperativ sofort eine Vollbelastung erlaubte. 12 Wochen nach der Operation wurde die Knochenheilung in Relation zur gesunden kontralateralen Seite evaluiert. Bei den Tieren traten weder Plattenbr√ľche noch Sekund√§rfrakturen auf. Histologische und ¬Ķ-computertomografische Ergebnisse zeigten eine gro√üe Menge mineralisierten Knochens sowie verdichtete Knochentrabekel und reichlich Knochenmark. Neue Knochentrabekel entstan¬¨den durch desmale Ossifikation ohne sichtbare Knorpel- oder Kallusbildung. Eine spezifische morphologische Analyse der Osteozytenlakunen veranschaulichte regelm√§√üig angeordnete sph√§rische Lakunen zusammen mit den zugeh√∂rigen Knochenkan√§lchen. Biomechanische Tests demonstrierten eine vergleichbare Steifigkeit in den operierten und nicht operierten Femora. Dabei war die Steifigkeit in den kortikalen doppelt so hoch wie in den trabekul√§ren Regionen. Histomorphometrische Analysen zweier wichtiger Knochenmatrix-Enzyme, der ALP (als Osteoblasten-Marker) und der TRAP (als Osteoklasten-Marker), ergaben eine signifikant erh√∂hte ALP-Aktivit√§t im operierten Femur. Sowohl durch immunhistochemische F√§rbungen als auch mithilfe der quantitativen PCR konnten aktive Knochenumbau-Prozesse durch die Expression der knochenaufbauenden Marker Col1A1, ALP, BGLAP, BMP2, ASMA, OPG sowie der knochenabbauenden Marker TRAP und CTSK nachgewiesen werden. Die biochemische Analyse der Knochenoberfl√§che durch die time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) ergab eine gro√üe Menge gleichm√§√üig verteilten Kalziums wie auch kollagener Komponenten. Die ultrastrukturelle Untersuchung der neu gebildeten Trabekel zeigte charakteristisch parallel angeordnete und gleichm√§√üig dicht mineralisierte Kollagen-Fibrillen. Aktive Osteoblasten konnten anhand ihrer w√ľrfelf√∂rmigen Gestalt, des zahlreich vorkommenden rauen endoplas¬¨matischen Retikulums sowie eines auff√§lligen Golgi-Apparates identifiziert werden, w√§hrend die aktiven Osteoklasten durch ihre Gr√∂√üe, die Mehrkernigkeit und ein ruffled border gepr√§gt waren. Die Ultrastruktur der Osteozyten variierte dem Mineralisierungslevel entsprechend. Reife sternf√∂rmige Osteozyten lagen eingeschlossen in vollst√§ndig mineralisierter Knochen¬¨matrix, w√§hrend sich junge Osteozyten im Bereich des Osteoids, bzw. teilweise in mineralisierte Matrix eingebettet fanden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass dieses neu etablierte metaphys√§re Fraktur-Modell im Schaf zuk√ľnftig f√ľr die Untersuchung der Knochenheilung und f√ľr neue Therapien zur Stimulation zur Heilung bei metaphys√§rern Frakturen genutz werden kann.
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