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Vergleich des Einflusses verschiedener Aktivierungsmethoden und Kultivierungsmedien auf die Vorkernausbildung nach intrazytoplasmatischer Injektion equiner Spermien in bovine Oozyten

Schlipf, Manuela


Originalveröffentlichung: (2019) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.587 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-148104
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14810/


Universität Justus-Liebig-Universität GieĂźen
Institut: Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit tierärztlicher Ambulanz
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6805-9
Sprache: Deutsch
Tag der mĂĽndlichen PrĂĽfung: 02.07.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 27.08.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Die ICSI stellt inzwischen im Bereich der IVP beim Pferd eine fest etablierte und viel genutzte Methode der Befruchtung dar, nicht zuletzt, weil die konventionelle IVF hier nach wie vor versagt. Zunächst wurde die IVM beim Pferd mit Maturationsraten von 48,2% etabliert. Erste Versuche zur ICSI beim Pferd wurden durchgeführt, jedoch mit bislang sehr geringen Teilungsraten (4,2%). Die heterologe ICSI bietet die Möglichkeit, eine bovine Oozyte als Modell zu nutzen und ein equines Spermium in diese zu injizieren, um so im Rahmen der Entwicklung der Zygote eine Aussage über die untersuchten Faktoren und gewonnenen Erkenntnisse auch aufs Pferd übertragen zu können. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis für die Abläufe innerhalb der Vorkernausbildung der Zygote zu gewinnen. Dazu wurden die Eizellen 18 Stunden nach der Injektion mit Hoechst 33342 gefärbt und beurteilt. Die der ICSI vorangegangene Behandlung der Spermien mit MitoTracker Green® FM ermöglichte dabei die Zuordnung einer der vorhandenen Vorkerne zum Spermienmittelstück und somit zur paternalen Seite. Das Vorhandensein von zwei ausgeschleusten Polkörpern bestätigte die erfolgreiche haploide Aktivierung der Eizelle im Rahmen der ICSI. Diese Methode ermöglichte eine genaue Aussage über die Erfolgsrate der ICSI. Im Rahmen dieser Versuche wurde zunächst der Einfluss der Glukosekonzentration im Kultivierungsmedium auf die Erfolgsrate der ICSI untersucht. Dazu wurden als Medien DMEM/F-12, SOFaa und SOFaa mit 16 mM Glukose eingesetzt und die Vorkernausbildung nach ICSI miteinander verglichen. Die ICSI und die Aktivierung der Eizelle erfolgte bei allen Gruppen mithilfe des Piezo-Elements. Die Ergebnisse zeigten, dass die Erfolgsraten der ICSI bei allen drei Gruppen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Um den Glukosestoffwechsel während der Vorkernausbildung genauer zu untersuchen wurde die Glukosekonzentration im Medium vor und nach der ICSI beziehungsweise der Sham- Injektion durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der Eizellen keinen Einfluss auf die Glukosekonzentration hat und, dass sich die Konzentrationen vor und nach der ICSI/Sham-Injektion in keiner der untersuchten Gruppen voneinander unterscheiden. Der Glukosestoffwechsel scheint also bei der Vorkernausbildung keine große Rolle zu spielen. Als weiterer Einflussfaktor auf die Erfolgsrate der ICSI wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle miteinander verglichen: Die Aktivierung mithilfe des Piezo-Elements, die chemische Aktivierung und eine Kombination aus beiden Methoden. Auch hier zeigten die Ergebnisse, dass die Wahl des Aktivierungsstimulus bei den gewählten drei Protokollen keinen signifikanten Einfluss auf die Erfolgsrate der ICSI hat. Bei den sham-injizierten Kontrollgruppen fiel jedoch auf, dass hier lediglich die chemisch aktivierte Gruppe hohe Raten einer erfolgreichen „haploiden“ Aktivierung zeigte. Bei der Gruppe, welche dahingegen mit der Kombination aus Piezo und chemischen Stimuli aktiviert wurde, waren die Raten der „diploiden“ Aktivierung signifikant höher. Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass der Piezo die Verhinderung des Ausschleusens des zweiten Polkörpers zur Folge hat, wobei der Verdacht aufkam, dass ein negativer Einfluss auf das mikrotubuläre Netzwerk als Folge der minimalen Vibrationen ausgeübt wurde. Hierzu sind jedoch weitere Untersuchungen speziell zum Einfluss des Piezos und seiner Auswirkungen auf die Struktur innerhalb der Eizelle, insbesondere auf das mikrotubuläre Netzwerk, im Rahmen der ICSI von Interesse. Um die weitere Entwicklung der Zygoten nach der ICSI beurteilen zu können, wurden die Teilungsraten der ICSI nach chemischer Aktivierung, nach Aktivierung mit der Kombination aus dem Piezo und chemischen Stimuli, nach Sham-Injektion und chemischer Aktivierung sowie lediglich chemisch aktivierter Eizellen bestimmt. Hier zeigte die Gruppe Piezo + CA deutlich höhere Teilungsraten (21,5%). Es bleibt jedoch zu vermerken, dass auch die Teilungsraten der Kontrollgruppen (1. Sham-injiziert und chemisch aktiviert 2. Chemische aktiviert) sehr gering waren und daher vermutet wird, dass das genutzte Medium SOFaa + 16 mM Glukose einen negativen Einfluss auf die Entwicklung der behandelten Eizellen hatte. Zusammenfassend bleibt zu sagen, dass die durchgeführten Versuche einen neuen Einblick in das Modell der heterologen ICSI geben. So muss beispielsweise der Einsatz des Piezo-Elements hinsichtlich seines Einflusses auf das Ausschleusen des zweiten Polkörpers weiter untersucht werden. Zudem können gewonnene Erkenntnisse bezüglich der Auswirkung der Glukosekonzentrastion im Kultivierungsmedium und der verschiedenen Aktivierungsmethoden auf die paternalen Vorkernausbildung auch aufs Pferd übertragen und dort angewandt werden.
Kurzfassung auf Englisch: In the last 20 years ICSI has become a well-established and often used technique in equine IVP whereas conventional IVF with horse gametes is still not reliably successful. At first the IVM of horse oocytes was resulting in maturation rates of 48,2%. First attempts of ICSI were performed but showed only little success, with cleavage rates of 4,2%. Interspecies fertilization gave us the opportunity to use bovine oocytes as a model and inject equine sperm. This approach can be transferred and used in equine ART. It was the goal of this work to obtain a better understanding of the pronuclear development in injected oocytes. Therefor the used sperm was stained with MitoTracker Green® FM directly before ICSI. Eighteen hours after ICSI the oocytes where stained with Hoechst 33342 to identify the paternal pronucleus by the sperm midpiece lying next to it. The presence of two polar bodies proofed the haploid status of the oocyte after activation during or after ICSI. This method allowed an exact evaluation of the success of ICSI. The first part of the study examined the influence of glucose in the culture medium on the success rate of ICSI. Therefor DMEM/F12, SOFaa and SOFaa with 16mM glucose were used for culture and the pronuclear development after ICSI was evaluated. The piezo-element was used for injection and activation of the oocyte. Results showed that there was no significant difference in the pronuclear development after ICSI between the 3 groups. To investigate the glucose metabolism during pronuclear development the concentration of glucose in the culture medium before and after ICSI and Sham-Injection was measured. The results showed that the activation of the oocyte did not affect the glucose concentration in the culture medium. The glucose concentration of the culture medium before and after ICSI showed no significant differences between the observed groups. Glucose metabolism does not seem to play an important role in pronuclear development. In order to better understand the influence of the activation stimulus on pronuclear development after ICSI three activation methods where compared: the piezo element, chemical activation and a combination of this two. Results showed that there was no significant difference in the success of ICSI between the compared groups. In the sham-injected groups only the oocytes chemically activated showed high rates of second polar body extrusion after activation. In the group activated both with piezo and chemically the rates of oocytes that did not extrude the second polar body and therefor had a diploid chromatin status where high. This could mean that the piezo somehow prevents the extrusion of the second polar body. It is assumed that the vibrations of the piezo might have a negative influence on the microtubular network of the oocyte. To confirm this further investigations of the piezo and its influence on the structures of the oocyte, especially the microtubular network, are needed. To evaluate further development of the oocytes after ICSI cleavage rates of the different groups were compared: ICSI – chemically activated, ICSI – activated with a combination of piezo and chemical activation, sham-injected oocytes – chemically activated, oocytes that were not injeceted but chemically activated. The group that was activated with piezo und chemical activation showed significantly higher cleavage rates of 21,5 %. Cleavage rates of the control groups remained low, therefore it is suggested that the used culture medium (SOFaa + 16mM glucose) might have a negative influence on the development of the treated oocytes. In summary the results give new insight into the model of interspecies ICSI. Thus the use of the piezo needs to be further investigated, especially considering its influence on second polar body extrusion. The findings of this study can be used to optimize ICSI in the horse.
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