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Analysen zur Regulation und Komposition der extrazellulären Matrix von Drosophila melanogaster

Analysen zur Regulation und Komposition der extrazellulären Matrix von Drosophila melanogaster

Töpfer, Uwe


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-147747
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14774/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Allgemeine und Spezielle Zoologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Tiere (Zoologie)
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 01.08.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein Netzwerk aus Proteinen, die sich im interzellulären Raum mit Zelloberflächenproteinen verknüpfen und so für die Stabilität von Geweben und Organen sorgen. ECM-Komponenten sind an Zellmigration, Differenzierung von Geweben oder auch an Signalwegen beteiligt. Bisherige Studien zeigen, dass an der Ausbildung einer ECM die hoch konservierten Komponenten Laminin, Perlecan, Nidogen, Kollagen IV und Kollagen XV/XVIII beteiligt sind. Dabei assemblieren sekretierte Laminin Heterotrimere durch Bindung an Zelloberflächenrezeptoren zu einem Laminin-Netzwerk. Die Linkerproteine Nidogen und Perlecan binden an dieses Netzwerk und ermöglichen die Bindung von Kollagenen.
Die Genregulation von ECM-Komponenten wurde bisher nur wenig untersucht, da man von einer Selbstassemblierung der ECM Proteine an der Zelloberfläche und einer Interaktion mit ihren Bindepartnern ausging, die unabhängig von ihrem Expressionsort abläuft. Die transkriptionelle Genregulation von Laminin-Untereinheiten in verschiedenen Geweben ist ein entscheidender Schritt für das Verständnis der Assemblierung von ECM in vivo. Durch Reportergenanalysen konnte eine gemeinsame Expression von Laminin B1 (LanB1) und Laminin B2 (LanB2) in frühen mesodermalen Zellen, in entodermalen und ektodermalen Darmprimordien sowie im Dotter und der Amnioserosa gezeigt werden. Somit scheinen Gewebe aus allen Keimblättern die Möglichkeit zu besitzen eine frühe gewebespezifische ECM selbst zu initiieren, die als Voraussetzung späterer Sekretion von Hämozyten und dem Fettkörper dienen könnte. Embryonen mit komplettem Verlust der Hämozytensekretion besitzen eine Laminin-haltige ECM, welche alle embryonalen Gewebe umhüllt und für die frühe Ausbildung der Gewebe ausreicht, allerdings nicht für die finale Differenzierung. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass beide untersuchten Laminin Gene durch cis-regulatorische Elemente in den großen intronischen Enhancern kontrolliert werden. In Abwesenheit des GATA-Faktors Serpent (Srp) ist die Laminin Reportergenexpression stark reduziert, was die Abhängigkeit des Großteils des Laminin Expressionsmuster von Srp Aktivität zeigt. Die direkte Bindung von Srp in den intronischen Enhancern von LanB1 und LanB2 konnte mittels ChIP-qPCR nachgewiesen werden. Zusätzlich zeigt ektopisch exprimiertes Srp in Muskelzellen eine Aktivierung der LanB1 und LanB2 Enhancerelemente in somatischen Muskeln. Diese Resultate zeigen eine übergreifende Rolle von Srp für die Laminin Regulation in den Geweben und Keimblättern von Drosophila.
Die Rolle von Nidogen (Ndg) wurde für die Verlinkung zwischen dem Laminin- und dem Kollagen-Netzwerk und der damit verbundenen Assemblierung der ECM interpretiert. Dementsprechend ist auch die Ndg Proteinsequenz von Drosophila in der vergleichenden phylogenetischen Analyse hoch konserviert, was mit der Zuordnung zum so genannten „basement membrane toolkit“ einhergeht. Trotzdem sind hypomorphe und auch amorphe Ndg Mutanten lebensfähig und zeigen darüber hinaus keine Differenzierungsstörungen von Geweben, wie es bei Verlust von allen anderen Komponenten des „basement membrane toolkit“ der Fall ist. Die darauffolgende Analyse der ECM-Komposition in Ndg Mutanten zeigt widersprüchliche Ergebnisse zu der bisher postulierten Rolle von Ndg als essentiellem Bindeglied zwischen den Laminin- und Kollagen-Netzwerken, da die Komponenten der Basallamina unverändert vorhanden sind. Ein Letalitätstest mit zunehmendem Alter der Elterntiere lässt zunächst auf eine altersabhängig steigende embryonale Letalität schließen, die mit fehlender Befruchtung in Zusammenhang gebracht werden konnte. Diese verminderte Fruchtbarkeit konnte sowohl auf verringerte Fertilität der Männchen wie auch der Weibchen zurückgeführt werden. In anschließenden Analysen konnte eine Rolle von Ndg in der Oogenese gezeigt werden, die auf einen Defekt in der Stammzellerneuerung oder auf physiologische Defekte hinweist. Die Ergebnisse zeigen, dass Ndg nicht für die Assemblierung der Basallamina verantwortlich ist, sondern eine wichtige Funktion für die reproduktive Fitness zeigt.
Der Abbau von ECM wird über Matrix Metalloproteinasen (Mmps) realisiert. Dabei konnte in vorherigen Studien schon eine entscheidende Rolle beider in Drosophila existierenden Mmp Gene für die Entwicklung gezeigt werden und darüber hinaus auch Unterschiede in der Substratspezifität. Die Analyse der Proteinverteilung während der Metamorphose deutet auf abweichende Rollen für die Degradierung und Remodellierung der ECM hin. Während Mmp1 eher im extrazellulären Raum agiert und auch auf histolysiertem Material zu detektieren war, konnte Mmp2 zu den Zeitpunkten an Membranen lokalisiert werden, wenn die ECM im starken Maße abgebaut wird. Durch Expressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass Mmp1 unter anderem Enhanceraktivität in Hämozyten aufzeigt, während Mmp2 in den Geweben exprimiert wird, in denen ECM degradiert bzw. remodelliert werden muss. Durch einen Knockdown von Mmp2 konnte eine für die Entwicklung entscheidende Rolle während der Metamorphose gezeigt werden. Der Verlust von Mmp2 führt zu fehlerhafter Kontraktion der viszeralen Muskulatur und einer unvollständigen Histolyse des larvalen Mitteldarms. Durch Analyse der ECM Komposition nach Knockdown von Mmp2 konnte gezeigt werden, dass Proteine der Basallamina an der viszeralen Muskulatur von Mmp2 degradiert werden. Die starke Expression in Hämozyten und die Proteinverteilung im extrazellulären Raum von Mmp1 sowie die gewebespezifische Expression und die membranständige Proteinlokalisation von Mmp2 deuten auf unterschiedliche Rollen der Mmps für den Ablauf der ECM Remodellierung während der Metamorphose hin.
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