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Klonierung und Expression des murinen RPGR Exon1-19

Laux, Mirjam Julia


Originalveröffentlichung: (2019) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (8.966 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-144508
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14450/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6779-3
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.04.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 14.05.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Die Retinitis pigmentosa (RP) zählt zur Gruppe der erblichen Netzhautdystrophien, die ein sehr komplexes Krankheitsbild mit unterschiedlichen Krankheitsverläufen aufweist und im Verlauf unter anderem zu Gesichtsfeldeinschränkungen und Erblindung führen kann. Die X-chromosomal vererbte RP stellt hierbei eine besonders schwere Form dar, die durch Mutationen in einer der beiden Hauptisoformen des RPGR Gens (RPGREx1-19 und RPGRORF15) gekennzeichnet ist. Die Isoformen zeichnen sich N-terminal durch die gleiche Sequenz, die auch RCC1-like domain (RLD) genannt wird, aus. In dieser Arbeit wurde ein Mausmodell (Rpgrtm1sti), welches zuvor durch Arbeitsgruppen der Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde der Justus-Liebig-Universität Gießen 2011 entwickelt wurde, genutzt. Durch eine dem Menschen ähnliche Punktmutation im ORF15 kommt es zur retinalen Degeneration. Ziel war die Klonierung und nachfolgende Expression eines rekombinant hergestellten RPGREx1-19 zur Generierung einer Positivkontrolle für zukünftige Westernblots. Zudem erfolgte die Testung eines neu designten Antikörpers, der gegen die RLD der beiden bekannten RPGR-Isoformen gerichtet ist. Dieser Antikörper sollte der genaueren Expressionsanalyse der bereits bekannten beiden Isoformen im Mausmodell dienen. Hierfür wurde die cDNA der RPGREx1-19 Isoform von Wildtypmäusen mittels Klonierung in XL1 Blue Zellen transformiert. In einem zweiten Schritt wurde mittels In-Fusion-Klonierung ein Expressionsvektor in BL21(DE3)-Zellen transfiziert und die Proteininduktion eingeleitet. Anhand dieser Proteinsequenz wurde ein Antikörper designt, welcher sowohl am rekombinant hergestellten Protein wie auch an verschiedenen murinen Gewebeproben im Westernblot getestet wurde. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei der rekombinant hergestellten RPGREx1-19 Isoform um eine vermutlich neue Isoform dieses Proteins handelt, welche zudem im Hirn von Mäusen erfolgreich nachgewiesen werden konnte. Der neu designte Antikörper detektiert eine schwache Expression der bekannten RPGREx1-19 Isoform in Niere und Leber, was durch einen weiteren N-terminalen Antikörper bestätigt wurde. Mit dieser Arbeit konnten weitere Einblicke in die Expression verschiedener Isoformen, welche zu einem gewebespezifisch aber auch zum anderen speziesspezifisch zu sein scheint, gewonnen werden. Die neu detektierte Isoform des RPGREx1-19 und ihr Nachweis im Hirn unterstreicht die Bedeutung der verschiedenen gewebeabhängigen Isoformen für das Verständnis des Krankheitsbildes der XLRP. Da eine teilweise ubiquitäre Expression des RPGREx1-19 beschrieben worden ist und klinisch in Analogie auch syndromale Krankheitsverläufe bekannt sind, könnte das hier rekombinant hergestellte Protein als Positivkontrolle in der Diagnostik einen wertvollen Beitrag leisten.
Kurzfassung auf Englisch: The retinitis pigmentosa is counted among inherited retinal dystrophies, which are characterized by a complexity of clinical symptoms with different disease progressions. They could end up in limitations of the visual field and subsequent blindness. The X-linked retinitis pigmentosa (XLRP) is an early-onset and phenotype, which is caused by mutation in the Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator (RPGR) resulting in two main isoforms RPGREx1-19 and RPGRORF15. The N-terminal part of both isoforms is similar and homologous to RCC1 (Regulator of Chromosome Condensation 1) and so called RLD.
In this study a mouse modell (Rpgrtm1sti) was used, which was previously developed in the department of ophthalmology of Justus-Liebig-University Giessen. It is distinguished by very similar mutation of ORF15 in comparison to human resulting in a retinal degeneration.
The aim of the following study was the cloning and the subsequent protein expression of RPGREx1-19, which could later on serve as a positive control in future western blots. Furthermore, a new antibody was generated targeting the RLD of both known isoforms to detect the expression pattern of them in different murine tissues.
Therefore, the cDNA of RPGREx1-19 from murine mouse was transformed by cloning in XL1 blue cells. Afterwards, an expression vector was transferred to BL21(DE3) cells through In-Fusion cloning to induce the protein expression of the isoform. An antibody against this protein sequence was designed and afterwards tested with the recombinant isoform as well as with different murine tissues in western blot analysis.
In this study, it was shown that the recombinantly expressed protein could be interpreted as a new isoform of RPGREx1-19, which was also detected in the brain. In addition, the newly designed antibody was able to detect the known isoforms in liver and kidney as well, which was confirmed by a second N-terminal binding antibody.
With the results of this study, it is possible to get a better understanding of the expression pattern of different isoforms, which seems to be influenced in tissue dependent as well as in species specific manner. The probably new isoform and its expression in the brain underlinses the importance of different isoforms and their understanding and influence in the setting of XLRP. As RPGR is well-known to have an ubiquitous expression and syndromal manifestations are possible, the recombinant protein could have a potential role in western blot diagnostics of different tissues.
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