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Der Einfluss einer SMAD- und AP-1-Inhibition durch √úberexpression von YB-1 und JDP2 auf die kontraktile Funktion des Herzens

Brockmann, Nils


Originalveröffentlichung: (2019) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.903 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-144010
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/14401/

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Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Physiologisches Institut
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6768-7
Sprache: Deutsch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 19.12.2018
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 24.04.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Die Transkriptionsfaktoren AP-1 und SMAD sind klassische Signalmolek√ľle von TGF-β, welchem eine entscheidende Rolle im kardialen Remodelling zugeschrieben wird. Eine Inhibition dieser Faktoren mittels AP-1- und SMAD-spezifischen Decoy-Oligonukleotiden als auch durch √úberexpression von YB-1 und JDP2, kann die Herzmuskelzellen vor der Apoptose- und Hypertrophie-Induktion durch TGF-β sch√ľtzen. YB-1 ist sowohl in der Lage den SMAD-Signalweg zu inhibieren als auch die AP-1-abh√§ngige Genexpression zu unterbinden. JDP2 dagegen inhibiert nur AP-1, indem es um die gleiche Bindungsstelle wie AP-1 konkurriert. Unklar war bisher, welche Auswirkungen die verschiedenen M√∂glichkeiten der Inhibition von AP-1 und SMAD auf die kontraktile Funktion von Herzmuskelzellen haben. Deshalb wurden Kontraktionsmessungen auf Zellebene nach YB-1- und JDP2-√úberexpression sowie nach Transformation von Herzmuskelzellen mit AP-1- und SMAD-spezifischen Decoy-Oligonukleotiden angefertigt. Zudem wurde mittels Westernblot die Expression der Proteine des Calciumhaushaltes nach YB-1- und JDP2-√úberexpression untersucht.
In dieser Arbeit wurde JDP2 f√ľr die Kontraktionsversuche f√ľr eine Woche √ľberexprimiert. Die √úberexpression wurde in doppelt-transgenen M√§usen generiert, die unter der Kontrolle eines Transaktivators JDP2 herzspezifisch √ľberexprimierten. Neben den Untersuchungen an den Herzen, die eine Woche JDP2 √ľberexprimierten, wurde f√ľr die Westernblots die JDP2-√úberexpression ebenfalls f√ľr vier und zehn Wochen generiert. Die YB-1-√úberexpression wurde mittels eines adenoviralen Konstrukts in adulten, isolierten Kardiomyozyten der Ratte f√ľr 24 und 48 Stunden generiert.
Die erhobenen Daten zeigen, dass sowohl nach einw√∂chiger JDP2-√úberexpression die Kontraktilit√§t auf Zellebene als auch in vivo in der Echokardiographie reduziert ist. Durch die YB-1-√úberexpression wurde ebenfalls die Kontraktilit√§t der isolierten Kardiomyozyten reduziert. In beiden Ans√§tzen blieb in vitro die β-adrenerge Ansprechbarkeit erhalten. Weder eine AP-1- noch SMAD-spezifische Inhibition durch Decoy-Oligonukleotide konnte die Kontraktilit√§t negativ beeinflussen. Dies legt den Schluss nahe, dass die Reduktion der Kontraktilit√§t durch JDP2 und YB-1 weder √ľber AP-1 noch √ľber SMADs vermittelt wird.
Die Westernblots nach JDP2-√úberexpression zeigten au√üerdem eine reduzierte SERCA-Expression, eine Reduktion des NCX und des β1-Adrenorezeptor nach zehn Wochen und eine verst√§rkte Expression des PLBs mit einem verminderten Phosphorylierungsstatus nach einer, vier und zehn Wochen JDP2-√úberexpression. Dies k√∂nnte die reduzierte kontraktile Funktion erkl√§ren. Unter YB-1 dagegen konnte eine erh√∂hte SERCA- und NCX-Expression nach 48 Stunden nachgewiesen werden. Dies scheint eher ein reaktiver Effekt der YB-1-√úberexpression zu sein.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass YB-1 und JDP2 durch ihren negativen Einfluss auf die kontraktile Funktion des Myokards nicht therapeutisch eingesetzt werden sollten. Andererseits wird deutlich, dass AP-1 und SMAD nach wie vor ein mögliches Target zur Verhinderung des kardialen Remodelings darstellen.
Kurzfassung auf Englisch: The transcription factors AP-1 and SMAD were detected as typical signalling molecules of TGF-β and thereby they are mediators of cardiac remodelling. By use of decoy-oligonucleotides with specific binding site for AP-1 and SMAD, but also by overexpression of the transcription factors JDP2 and YB-1 processes of cardiac remodelling such as hypertrophy and apoptosis could be prevented in ventricular cardiomyocytes. JDP2 binds AP-1-subunits and AP-1-specific promoter elements. Both lead to inactivated transcription of AP-1. YB-1 is able to interfere in SMAD-signalling pathways and also inhibits the AP-1-signalling. The influence of JDP2- and YB-1-overexpression as well as specific AP-1- and SMAD-inhibition on the contractile function was still unclear. I, therefore, investigated, if overexpression of JDP2 in transgenic mice influences contractile function at the cellular level and in echocardiography. In another approach, cardiomyocytes were either transfected with adenovirus for YB-1 overexpression or transformed with decoy-oligonucleotides for specific SMAD- and AP-1-inhibition, and the contractile function was analysed. Furthermore the expression of the proteins from the calcium signalling pathway after YB-1- and JDP2-overexpression was examined by western blots.
The results showed that JDP2-overexpression for one week as well as the YB-1-overexpression impair the contractility of cardiomyocytes. In both approaches β-adrenergic responsiveness was maintained in vitro. The echocardiography also showed a decreased cardiac output after one week JDP2-overexpression. Neither the AP-1- nor the SMAD-specific inhibition by decoy-oligonucleotides influenced the contractile function of the cardiomyocytes. These results indicate that the impact of YB-1 and JDP2 on the contractile function of cardiomyocytes is not mediated by AP-1 or SMAD, but is more likely mediated via other transcription inhibitory pathways.
The western blots of cardiac proteins after one week JDP2-overexpression revealed a reduced SERCA-expression, a reduction of NCX and β1-adrenorezeptor after ten weeks and also an increased expression of PLB in association with a decreased phosphorylation of PLB after one, four and ten weeks JDP2-overexpression. All of these changes can be due to altered calcium handling and could, thus, explain the reduction of the contractile function of the myocardium under JDP2.
On the other hand the results of the western blots after YB-1-overexpression showed an increased expression of SERCA and NCX after 48 hour. This seems to be a compensatory effect due to the decreased contractile function upon YB-1 overexpression.
In conclusion, overexpression of JDP2 and YB-1 in transgenic mice or adult cardiomyocytes of rats leads to impairment of contractile function. These transcriptions factors should, therefore, not be used for therapeutically application. On the other hand the specific inhibition of AP-1 or SMADs for inhibition of hypertrophy and apoptosis in absence of contractile impairments is still possible target for prevention of cardiac remodelling.
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