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Lipasen aus Speisepilzen für den Einsatz in der Käserei

Kreuter, Nadja


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-139438
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2019/13943/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Lebensmittelchemie und Lebensmittelbiotechnologie
Fachgebiet: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 16.01.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Bestimmte Käsesorten, wie z.B. Provolone oder Feta, werden üblicherweise unter Verwendung von Lipasen aus der Zungenwurzel von Ziegen, Schafen oder Kälbern hergestellt, um deren charakteristisches Geschmacksprofil zu generieren. Aufgrund der wachsenden Bedeutung von koscher- bzw. halal-zertifizierten Produkten ist es interessant, Lipasen mit ähnlichen katalytischen Eigenschaften aus Speisepilzen (Basidiomyceten) zu gewinnen. Dafür waren ausschließlich Wildtyp-Stämme vorgesehen, um ein „natürliches“ und „gentechnikfreies“ Produkt zu gewinnen.
In einem Screening in Submerskultur wurden insgesamt 31 verschiedene Speisepilze auf die Sekretion geeigneter Lipasen getestet. Anhand von photometrischen Assays wurde das Esterase-/Lipase-Sekretionsprofil der Basidiomyceten substratspezifisch in Abhängikeit von der Acyl-Kettenlänge verschiedener p-Nitrophenylester quantitativ erfasst. Die Selektion vielversprechender Produktionsorganismen erfolgte durch den Vergleich mit dem Hydrolyseprofil der Ziegenzungengrundlipase (Handelsprodukt „opti-zym z10uc“). Anschließend erfolgte eine Optimierung der Kulturparameter durch Einsatz verschiedener Nährmedien. Des Weiteren wurde die Sekretion der extrazellulären Lipasen durch Zusatz geeigneter Induktoren wie Butterschmalz, Butter und Quarkfett gesteigert.
In Kooperation mit dem Projektpartner optiferm GmbH wurden Applikationstests durchgeführt. Dazu wurden aus jeweils 10 bzw. 3 Liter Milch Käselaibe der Käsesorte Weichkäse vom Typ Feta unter Lipase-Zusatz erzeugt. Die Testkäse wurden für 30 Tage bei 10 bis 15 °C gereift und anschließend für weitere 12 Wochen bei 4 °C gelagert. Über den Reifungs- und Lagerungszeitraum hinweg wurden die generierten Käsespezialitäten jeweils im Vergleich zum Referenzprodukt Ziegenlipase sensorisch beurteilt. Begleitend erfolgt eine umfassende instrumentell-analytische Charakterisierung der durch die Lipasen freigesetzten Fettsäuren. Die produzierten Käse wurden mittels Festphasenmikroextraktion (SPME) in Kopplung mit der gaschromatographischen Analyse mit massenspektrometrischer Detektion auf die Anwesenheit von freien Fettsäuren hin untersucht.
Die Herstellung von Käselaiben erfolgte mit folgenden Basidiomyceten: Lentinus squarrosulus, Auricularia fuscosuccinea, Flammulina velutipes, Pleurotus citrinopileatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus flabellatus und Lycoperdon pyriforme, deren sekretierte Enzyme mittels unterschiedlicher Verfahren gereinigt und konzentriert wurden. Am erfolgreichsten in Bezug auf die sensorischen Eigenschaften und den Vergleich der freien Fettsäuren war die Umsetzung mittels F. velutipes und P. citrinopileatus nach Fällung mit Ammoniumsulfat und Konzentrierung mittels Vivaflow200. Die anderen Kandidaten erwiesen sich als weniger geeignet für den Einsatz in Käse.
Die Isolierung der Lipasen aus dem Kulturüberstand der Basidiomyceten F. velutipes und P. citrinopileatus erfolgte mittels Schaumfraktionierung, Ammoniumsulfatfällung und anschließender zweistufiger chromatographischer Reinigung mittels Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) an einer schwachen Ionenaustauscher- und einer Größenausschlusssäule.
Die gereinigten Enzympräparationen aus F. velutipes und P. citrinopileatus wurden anschließend biochemisch charakterisiert. Dies erfolgte mittels elektrophoretischer Methoden wie der isoelektrischen Foskussierung (IEF) und der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Des Weiteren wurden Zymogramme unter seminativen Bedingungen zur Visualisierung der Lipase-Aktivität angefertigt. Anhand der gereinigten Enzyme wurden Temperatur- und pH-Optima sowie die enzymkinetischen Parameter Km und vmax bestimmt.
Zur molekularbiologischen Charakterisierung wurden die gereinigten Enzyme mittels Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) ansequenziert. Parallel dazu erfolgte die Entnahme von Myzel jeweils zum Zeitpunkt maximaler spezifischer Enzymaktivität im Kulturüberstand. Das Myzel wurde anschließend zur RNA-Isolierung mittels RNeasy® Plant Mini Kit unter flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Es folgte die Erststrangsynthese mittels reverser Traskription der Gesamt-RNA in cDNA. Anhand der Peptiddaten wurden Primer abgeleitet, die zur Amplifizierung der für das jeweilige Zielenzym codierenden cDNA mittels Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt wurden. Das Zielenzym aus F. velutipes konnte mit insgesamt neun verschiedenen Primern aus der genomischen DNA sequenziert werden. Aufgrund der höheren Aktivität gegenüber Substraten mit kurzkettigen Acyl-Resten kann das Enzym funktionell den Carboxylesterasen zugeordnet werden.
Kurzfassung auf Englisch: The characteristic aroma profile of certain cheeses such as Provolone or feta is generated by addition of calf, kid coat, or lamb pregastric esterases to the cheese milk. Due to the demands of vegetarians and the fast-growing market of kosher and halal-certified products, alternative lipases derived from edible mushrooms (basidiomycetes) with the ability to create similar aroma profiles are highly sought-after. For this purpose, only wild-type strains are of interest in order to obtain a “natural” and “GMO-free” product.
In a broad screening, various mushrooms were tested in submerged cultures for the secretion of appropriate lipases. Based on photometric assays, the esterase/lipase secretion profiles of the basidiomycetes were quantified in a substrate-specific manner depending on the acyl chain length of various p-nitrophenyl esters and compared to the hydrolysis profile of the commercial lipase product from the root of tongue of goats (trade product “opti-zym z10uc”). The cultivation parameters of the most-promising mushrooms were subsequently optimized by using different nutrient media in order to increase the secretion of extracellular lipases. Furthermore, the secretion of extracellular lipases was elicitated by adding suitable inducers such as concentrated butter, butter and fat of regular quark.
Application tests of promising enzymes were performed in cooperation with the project partner optiferm GmbH. Feta-type cheese was prepared from 10 or 3 litres of milk by the addition of different lipases. The cheeses were ripened for 30 days at 10 to 15 °C and then stored for another 12 weeks at 4 °C. During the whole ripening and storage process, the sensory properties of the cheese were analyzed and compared to those prepared with the recference product “opti-zym z10uc”. A GC-MS-based method was developed and the produced cheese samples were analysed for the presence of free fatty acids by solid phase microextraction coupled to gas chromatography using mass spectrometric detection.
The cheese samples were prepared using enzymes derived from the following basidiomycetes: Lentinus squarrosulus, Auricularia fuscosuccinea, Flammulina velutipes, Pleurotus citrinopileatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus flabellatus and Lycoperdon pyriforme. The enzyme preparations were purified and concentrated by various methods. Most successful in terms of sensory properties and the release of free fatty acids were the extracellular enzymes from F. velutipes and P. citrinopileatus after precipitation with ammonium sulphate and concentration by means of Vivaflow200. Other candidates proved to be less suitable for application in cheese production.
The isolation of the lipases from the culture supernatant of basidiomycetes F. velutipes and P. citrinopileatus was performed by means of foam fractionation, ammonium sulfate precipitation and subsequent two-stage chromatographic purification by means of fast protein liquid chromatography (FPLC) on a weak anion exchange column and a size exclusion column.
Subsequently, the purified enzyme preparations from F. velutipes and P. citrinopileatus were biochemically characterized by electrophoretic methods such as isoelectric foscussing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Furthermore, zymograms were prepared under seminative conditions to visualize the lipase activity. The purified enzymes were used to determine temperature and pH optima as well as the enzyme kinetic parameters Km and vmax.
For molecular biological characterization, the purified enzymes were sequenced by electrospray tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Parallel to this, mycelium samples were collected from the culture supernatant at the time of maximum specific enzyme activity. The mycelium was ground under liquid nitrogen for RNA isolation using the RNeasy® Plant Mini Kit.
This was followed by first strand synthesis by reverse transcription of the total RNA into cDNA. Based on the peptide data, primers were derived which were used to amplify the cDNA coding for the respective target enzyme by polymerase chain reaction (PCR). The target enzyme from F. velutipes could be sequenced from the genomic DNA applying a total of nine different primer pairs. Due to the higher activity towards substrates with short-chain acyl residues, the enzyme is functionally classified as carboxylesterase.
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