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Ein revers-genetisches System für nicht kultivierbare feline Coronaviren als Grundlage für das Studium der felinen infektiösen Peritonitis

Ehmann, Rosina


Originalveröffentlichung: (2018) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (10.239 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-138002
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2018/13800/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6725-0
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.08.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 15.11.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Die feline infektiöse Peritonitis (FIP) zählt zu den bedeutendsten infektiösen Todesursachen bei Katzen und wird durch den letalen Biotyp (FIPV) von felinen Coronaviren (FCoVs) verursacht. Diese FIPVs entstehen aus dem klinisch inapparenten enteralen Biotyp (FECV) durch bisher unbekannte Veränderungen im Genom. Die Erforschung der Pathogenese der FIP wird dadurch erschwert, dass FCoV-Feldviren nicht in vitro kultiviert werden können. Die zur Verfügung stehenden zellkulturadaptierten FCoV-Laborstämme sind zur Aufklärung der molekularen Pathogenese der FIP nicht geeignet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein revers-genetisches System für ein FECV etabliert, welches erstmals die Erzeugung rekombinanter FECV-Feldviren ausgehend von einem cDNA-Klon ermöglichte. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erzielt:
1) Als Grundlage für die Etablierung eines revers-genetischen Systems wurde die gesamte Sequenz eines FECV-Feldvirus bestimmt. Der in dieser Arbeit verwendete Stamm wies den für feline Coronaviren typischen Genomaufbau auf.
2) Um zu zeigen, dass die bestimmte FECV-Sequenz die Replikation in infizierten Zellen ermöglicht, wurde recFECV-S79 hergestellt. Hierzu wurde das Genom des FECV-Feldvirus als cDNA in das Genom des Vacciniavirus, welches als Vektor fungiert, integriert, wobei die Sequenz des S-Gens von einem zellkulturadaptierten FCoV stammte. Ausgehend von diesem infektiösen Klon (vrecFECV-S79) konnten erfolgreich rekombinante FECVs mit heterologem Spikeprotein (recFECV-S79) hergestellt werden.
3) Anschließend wurde ein infektiöser Klon mit dem authentischen S-Gen (vrecFECV) generiert. Die erfolgreiche Herstellung von recFECV wurde mit verschiedenen Verfahren gezeigt. Zunächst wurden Coronavirus-typische Partikel im Elektronenmikroskop detektiert. Mithilfe eines M-Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpers konnten diese Partikel in einem Western Blot als FCoVs identifiziert werden. Ein Capsid Protection Assay mit anschließender RT-PCR bzw. qRT-PCR ermöglichte den Nachweis genomischer FCoV-RNA in den gereinigten recFECV-Partikeln.
4) Weiterhin wurde durch Infektion von SPF-Katzen untersucht, ob recFECV in der Lage war, im natürlichen Wirt eine produktive Infektion zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass infizierte Katzen recFECV über mehr als acht Wochen ausschieden und serokonvertierten. Nach Beendigung des Experiments wurde die Verbreitung von recFECV in unterschiedlichen Organen durch RT-PCR und Immunhistochemie untersucht. Aus den im Tierversuch gewonnenen Daten geht hervor, dass recFECV im natürlichen Wirt eine symptomlose persistente Infektion ähnlich wie bei einer natürlichen FECV-Infektion hervorgerufen hat.
Somit stellt das in dieser Arbeit etablierte revers-genetische System für ein FECV-Feldisolat ein ausgezeichnetes Werkzeug zur gezielten Erforschung der molekularen Pathogenese der FIP dar.
Kurzfassung auf Englisch: Feline infectious peritonitis (FIP) belongs tot he most important fatal infectious diseases of cats and it is caused by FIPV which represents the lethal biotype of feline coronavirus (FCoV). FIPVs evolve from the benign enteric biotype (FECV) by so far unidentified mutations. Studies to elucidate the molecular pathogenesis of FIP are limited by the inability to propagate FCoV field viruses in vitro. Though cell culture-adapted laboratory FCoV strains are available, they are unsuitable to study the molecular pathogenesis of FIP. In this study, a reverse genetics system for an FECV was established, which enabled fort he first time the production of recombinant FECV field virus from a cDNA clone. The following results were obtained:
1) Fort he establishment of a reverse genetics system the complete sequence of an FECV field strain was determined. The field virus used in this study followed the typical genome organization of feline coronavirus.
2) To confirm that the sequence determined fort he FECV field strain enabled replication in infected cells, recFECV-S79 was produced. For this purpose, the genome of the FECV field virus containing the S-gene sequence from a cell culture-adapted FCoV was introduced as a cDNA into the vaccinia virus genome which served as a vector. From this infectious clone (vrecFECV-S79), recombinant FECVs with heterologous spike proteins (recFECV-S79) could be successfully recovered.
3) Subsequently, an infectious clone with the authentic field isolate S-gene (vrecFECV) was generated. Successful recovery of recFECV was demonstrated by a set of different assays. Particles with the characteristic morphology of coronaviruses could be detected in transmission electron microscopy. Furthermore, Western blot analysis using an anti FCoV-M monoclonal antibody verified the particles as recFECV. Capsid protection assay follwed by RT-PCR or qRT-PCR demonstrated the presence of FECV genomic RNA in purified recFECV particles.
4) Furthermore, the ability of recFECV to establish a productive infection in the natural host was tested by infection of SPF cats. It was shown that infected cats seroconverted and shed recFECV continuously for over eight weeks. After termination of the experiment, various organ samples were analyzed fort he presence of FECV by RT-PCR and immunohistochemistry. The animal experiment revealed that recFECV established a symptomless persistent infection in the natural host similar to infections caused by FECV in the field.
Taken together, the data presented demonstrated that the reverse genetics system for an FECV field virus established in this study represents an excellent tool to study the molecular pathogenesis of FIP.
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