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Entwicklung eines DNAzyms gegen Biofilm bildende Pseudomonaden bei Zystischer Fibrose

Höfer, Frank Gregor


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-134856
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2018/13485/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Medizinische Mikrobiologie; Institut für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie, THM Gießen
Fachgebiet 1: Biochemie (FB 08)
Fachgebiet 2: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 22.02.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Zystische Fibrose ist eine autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung die mit chronischen Infektionen der Atemwege einhergeht. Besonders Infektionen mit Biofilm bildenden Pseudomonaden führen zu einem Verlust der Lungenfunktion und reduzieren die Wirksamkeit von Antibiotika. Die unerwünschten Arzneimittelwirkungen bisheriger Antibiotika machen ihre Therapien problematisch und es gibt bislang keine zielgerichtete Behandlung gegen Biofilm bildende Bakterien. In dieser Arbeit sollte ein DNAzym entwickelt werden, dass durch Posttranskriptionelles Gen-Silencing ein biofilmrelevantes Gen ausschaltet. Für den mukoiden Biofilm ist das Exopolysaccharid Alginat von P. aeruginosa verantwortlich. Die mRNA des Gens algD wurde als Ziel identifiziert, da sein Protein AlgD die Monomere für die Alginat-Synthese bereitstellt. Um häufig vorkommende Punktmutationen innerhalb des bakteriellen Gens mit den DNAzymen zu umgehen, wurden zunächst klinische Stämme sequenziert und eine Konsensussequenz erstellt. Für vielversprechende DNAzym-Kandidaten wurde ein Screening durchgeführt. Dafür wurde ein neues Verfahren entwickelt, dass auf HPLC basiert und mit dem die Geschwindigkeit von DNAzymen ohne aufwendige Bearbeitung der Proben dargestellt werden kann. Das neue Verfahren wurde charakterisiert und mit dem bekannten DNAzym Dz13 validiert. Die vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten des Verfahrens wurden aufgezeigt und dabei verschiedene Aspekte der Wirkstoffklasse der DNAzyme untersucht. Das schnellste gegen algD gerichtete DNAzym wurde modifiziert und seine Biofilmwirkung untersucht. Dafür wurden zunächst die Biofilme von nicht-mukoiden und mukoiden P. aeruginosa Patientenisolaten charakterisiert. Es konnte nur eine geringe Biofilminhibition gemessen werden. Als Problematik wurde die Sekundärstruktur von algD-mRNA identifiziert und Lösungsansätze für diese Problematik wurden mit Modifikationen des DNAzyms exemplarisch aufgezeigt. Die geringfügige Änderung der Biofilmmenge wurden auf off-target Effekten des für das Drug Delivery verwendeten zellpenetrierenden Peptids zurückgeführt. Dafür wurde das Wachstumsverhalten mit Tobramycin und dem Vergleichspeptid SMAP-29 aufgezeichnet, das für seine antimikrobielle Wirkung bekannt ist.
Kurzfassung auf Englisch: Cystic Fibrosis is an autosomal-recessive inherited metabolic disorder that is accompanied by chronic infections of the lung. Especially infections with biofilm forming Pseudomonads lead to a loss of lung function and reduce the efficacy of antibiotics. Undesirable side effects of recent antibiotics make their therapy problematic and until now there is no targeted treatment against biofilm forming bacteria. In this work a DNAzyme should be developed that post transcriptionally silences a biofilm relevant gene. The mucoid biofilm derives from the exopolysaccharide alginate of P. aeruginosa. The mRNA of the gene algD was identified as target gene, because its protein AlgD provides the monomers of the alginate biosynthesis. To evade frequently occurring point mutations within the bacterial gene with the DNAzyme, algD of several clinical strains were sequenced and a consensus sequence was compiled. For promising DNAzyme candidates a screening was carried out. For that a new HPLC based method was developed that determines the cleavage speed of DNAzymes without complex sample processing. The new method was characterized and validated with the established DNAzym Dz13. The versatile possible applications of the method were demonstrated by investigating various aspects of the class of DNAzymes. The fastest cleaving DNAzyme designed against algD was modified and its impact on biofilm formation was investigated. Therefore, biofilms of non-mucoid and mucoid P. aeruginosa patient isolates were characterized in advance. Only a minor reduction of biofilm was measured. Addressing the secondary structure of algD-mRNA with the DNAzyme was identified to be a difficulty and a problem-solving approach with modified DNAzymes was shown. The minor reduction of the biofilm-quantity was led back to off-target effects that were most likely caused by the cell-penetrating-peptide, which was coupled to the DNAzyme for drug delivery reasons. Therefore, the growth behavior in presence of tobramycin and the comparison peptide SMAP-29 was determined, which is known for its antibacterial activity.
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