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Vergleich des Einflusses der mTor-Inhibitoren Rapamycin und Torin2 auf die Reifung von Rindereizellen und Charakterisierung der Entwicklungskompetenz Torin2-behandelter Rindereizellen

Kreißelmeier, Manuela


Originalveröffentlichung: (2017) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (7.301 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-129850
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2017/12985/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinikum Veterinärmedizin, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6593-5
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.06.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 20.07.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Für einen ungestörten Ablauf der Oozytenreifung (Entwicklung vom GV- zum M II-Stadium) ist eine genaue räumliche und zeitliche Regulierung der in der Säugetier-Eizelle stattfindenden Genexpression auf Ebene der Translation von entscheidender Bedeutung. Einer der Initiationsfaktoren, die dabei eine wichtige Rolle spielen, ist eIF4E. Dieser Faktor bindet an die Cap-Struktur der mRNAs. Ebenfalls an der Kon-trolle der Translation beteiligt ist mTor, eine Ser/Thr Protein-Kinase, die 4E-BP1, ein Protein, das an eIF4E bindet und die Translation unterdrückt, reguliert. mTor agiert als katalytische Untereinheit zweier Multiprotein-Komplexe. Dies sind mTorc1, das Raptor enthält, und mTorc2, das Rictor als Komponente besitzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene mTor-Inhibitoren, Rapamycin und Torin2 wäh-rend der In-vitro-Maturation von Rindereizellen angewendet. Diese Substanzen können eine Abgrenzung der jeweiligen mTorc1- und mTorc2-Funktionen ermögli-chen. Die infolge der Inhibitor-Behandlungen erzielten Effekte wurden mittels mor-phologischer Beurteilung anhand der Chromatinkonfiguration, durch biochemische Untersuchungen mittels Western-Blot und durch immunhistochemische Analysen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie überprüft.
Während Torin2 eine Arretierung von 60% der Eizellen in der M I-Phase verursacht, inhibiert Rapamycin bei einem Teil der behandelten Eizellen die asymmetrische Zellteilung einschließlich der Ausschleusung des ersten Polkörpers. Die biochemischen und immunhistochemischen Analysen ergaben ein weitgehend konstantes Vorkommen der untersuchten Faktoren und Zielmoleküle (eIF4E, BP1, mTor, Raptor, Rictor, rpS6) im Verlauf der In-vitro-Maturation. Für alle Faktoren, außer für Raptor, das sich gegensätzlich verhält, zeigt sich im GV-Stadium eine niedrige, im M II-Stadium dagegen eine hohe Phosphorylierung. Rapamycin hat keinerlei Auswirkungen auf den Phosphorylierungszustand der untersuchten Faktoren, Torin2 hingegen hemmt spezifisch die BP1-Phosphorylierung an Thr37/46. Überraschenderweise wird weder durch Rapamycin noch durch Torin2 die rpS6-Phosphorylierung blockiert. Im Rahmen der immunhistochemischen Analysen wurde außerdem für manche Faktoren ein spezifisches Verteilungsmuster innerhalb der Eizelle gesehen, was für eine nicht nur zeitlich, sondern auch räumlich regulierte Translationskontrolle bei Rindereizellen spricht. Schlussendlich konnte kein Rapamycin-sensitives Zielmolekül bei Rindereizellen identifiziert werden, das eine Erklärung für die beobachteten morphologischen Rapamycin-Effekte liefern könnte. Zusätzlich zu den bisher erwähnten Untersuchungen wurden im Rahmen dieser Arbeit Torin2 behandelte Rindereizellen außerdem fertilisiert und kultiviert und die Blastozystenrate bestimmt. Es zeigte sich, dass diese Eizellen fähig sind, sich zu Blastozysten weiterzuentwickeln.
Die hier vorgestellten Untersuchungen ermöglichen Einblicke in regulatorische Me-chanismen, die bei der Oozytenreifung eine Rolle spielen (insbesondere in die räumliche und zeitliche Steuerung der Translation) und können als Grundlage für weitergehende Forschung dienen. Als ein langfristiges Ziel solcher Forschung wäre die Steigerung der Erfolgsrate beim Transfer durch IVP erzeugter Embryonen anzusehen.
Kurzfassung auf Englisch: An exact spatiotemporal regulation of gene expression in mammalian oocytes at translation level is absolutely necessary to guarantee an unimpaired course of meiot-ic progression (transition from GV-stage to M II). One of the specific initiation factors playing an important role in this process is eIF4E. This factor binds the mRNA cap-structure. Also involved in translational control is mTor, a Ser/Thr kinase regulating 4E-BP1, a protein binding eIF4E and repressing translation. mTor acts as catalytic subunit of two multiprotein-complexes. These are mTorc1 containing Raptor and mTorc2 harboring Rictor. Within the framework of this study two different inhibitors of mTor, Rapamycin and Torin2, were used during bovine oocyte in vitro matura-tion. Those substances may allow discrimination between mTorc1 and mTorc2 com-plex functions. The effects of the inhibitors were monitored by morphological exami-nation via reference to chromatin configuration, biochemical analysis by means of Western blotting and immunohistochemical analysis by means of confocal laser scanning microscopy.
Whereas Torin2 arrests approx. 60% of the oocytes at the M I stage, Rapamycin inhib-its asymmetric division including polar body extrusion within a part of the treated oocytes. Biochemical and immunohistochemical analysis revealed broadly equal abundance of the factors and targets investigated (eIF4E, BP1, mTor, Raptor, Rictor, rpS6) in the course of IVM. Phosphorylation analysis showed low phosphorylation in GV-stage and high signals in M II for all factors except Raptor, which shows an opposite behavior. Rapamycin has no impact on the phosphorylation status of the factors investigated, Torin2 however inhibits specifically BP1 phosphorylation at Thr37/46. Surprisingly, rpS6 phosphorylation is blocked neither by Rapamycin nor by Torin2. Moreover, within the scope of immunohistochemical analysis a specific pattern of distribution within the oocyte was seen for some factors, suggesting not only a temporal but also a spatial regulation of translational control within bovine oocytes. In conclusion, no Rapamycin sensitive target explaining the morphological effects of Rapamycin observed could be identified in bovine oocytes. In addition to the investigations mentioned, within the framework of this study, Torin2 treated bo-vine oocytes were also fertilized and cultured. The blastocyst rate was determined. It became apparent that these oocytes are capable to develop to the blastocyst stage.
The investigations presented here provide insights into the regulatory events in-volved in meiotic maturation (especially into spatiotemporal control of translation) and can serve as basis for further research. The improvement of the yield of offspring after transfer of IVP-derived embryos could be a long-term target of such research.
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