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Phänotypische und genotypische Charakterisierung von ESBL-/AmpC-beta-Laktamase- und Carbapenemase-bildenden Escherichia coli- und Klebsiella spp.-Isolaten aus klinischem Untersuchungsgut von Haustieren

Stolle, Inka


Originalveröffentlichung: (2017) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-128145
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2017/12814/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6559-1
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.03.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 16.05.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die weltweite Ausbreitung von Extended-Spektrum Beta-Laktamase (ESBL)- und Carba-penemase (CP)-bildenden Enterobacteriaceae gilt derzeit als eine der größten Herausforde-rungen für das öffentliche Gesundheitswesen. Tiere werden vielfach als Quelle von ESBL-Bildnern beschrieben, während ihre Bedeutung als Träger und Überträger von CP-bildenden Bakterien weitestgehend unerforscht ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, ESBL-/ CP-bildende Escherichia coli (Ec)- und Klebsiella (K.) spp.-Isolate von Hobby- und Nutztieren (Rind/Schwein) zu charakterisieren. Für einen Vergleich mit den bei Menschen beschriebe-nen Resistenztypen und internationalen Klonen wurden die ESBL-/CP-Varianten und Ec/K. pneumoniae (Kp)-Sequenztypen bestimmt. Die Analyse der bei extraintestinal patho-genen Ec (ExPEC) und intestinal pathogenen Ec beschriebenen virulenzassoziierten Genen (VAGs) diente der Zuordnung der Ec-Isolate zu Pathotypen. Schließlich wurde überprüft, inwieweit ein Resistenzplasmid die Biofilmbildung der Bakterien beeinflusst.
Im Zeitraum von Juni 2012 bis Februar 2014 wurden 3582 Ec-, 457 Kp- und 132 K. oxytoca (Ko)-Isolate von überwiegend kranken Nutz- und Hobbytieren aus bakteriologischem Unter-suchungsgut von > 400 Tierarztpraxen/-kliniken untersucht. Es konnten 280 Ec-, 44 Kp- und 5 Ko-Isolate als ESBL-Bildner bestätigt werden, zudem wurden 38 bzw. 11 AmpC-β-Laktamase (AmpC)-bildende Ec- und Klebsiella spp.-Isolate identifiziert. ESBL-/AmpC-bildende Ec-Isolate traten am häufigsten bei Rindern (17,4 %) und Hunden (11,1 %) auf. ESBL-bildende Klebsiella spp.-Isolate wurden am häufigsten bei Hunden (22,3 %) nachge-wiesen, bei Nutztieren kamen sie deutlich seltener vor (Rind: 2,6 %, Schwein: 1,6 %). AmpC-bildende Klebsiella spp.-Isolate kamen nur beim Hund vor. Isolate aus Wunden, die aus-nahmslos von Hobbytieren stammten, zeigten die höchste Rate an ESBL-/AmpC-Bildnern (Ec: 22,1 %, Klebsiella spp.: 60,0 %), gefolgt von Isolaten aus Urin, Haut- und Haarproben sowie Kot.
Der häufigste ESBL-Typ bei Ec war CTX-M-1 (58,9 %), gefolgt von CTX-M-15 (23,9 %), CTX-M-14 (6,4 %) und weiteren Typen, wie SHV-12 (6,1 %) und CTX-M-3 (1,8 %). CTX-M-1 wurde vermehrt bei Nutztieren (Rind: 17 %, Schwein 52,7 %, Hund und Katze: 14,5 %), die bei Menschen weit verbreitete ESBL CTX-M-15 hingegen vermehrt bei Hobbytieren (Hund und Katze: 44,8 %, Rind: 16,4 %, Schwein: 14,9 %) nachgewiesen. SHV-12 trat fast aus-schließlich bei Hobbytieren auf. Bei den ESBL-bildenden Klebsiella spp.-Isolaten dominierte CTX-M-15 (71,4 %). Die häufigste AmpC bei den Ec-Isolaten war CMY-2 (n=29); DHA-1 und ACC-4 konnten jeweils einmal nachgewiesen werden. Unter den Klebsiella spp.-Isolaten dominierte die AmpC DHA-1 (28 %). Für 12 der 38 AmpC-bildenden Ec-Isolate konnte eine Mutation im Bereich des AmpC-Promotors festgestellt werden, die eine Hyperproduktion von AmpC bedingt. Nahezu alle ESBL-/AmpC-bildenden Klebsiella spp.-Isolate sowie 21,7 % der Ec-Isolate besaßen mindestens eines der Fluorchinolonresistenzgene qnr, oqxA/B und aac(6´)-Ib-cr.
Acht (8,2 %, 8/97) ESBL-bildende intestinale Ec-Isolate von Schweinen wurden als enteroto-xische Ec (ETEC), zwei als atypische enteropathogene Ec (aEPEC) identifiziert. Ein Großteil der ESBL-/AmpC-bildenden Ec-Isolate wurde den Phylogruppen A (41,5 %) und B1 (24,8 %) zugeordnet. Eine Eingruppierung in die eher ExPEC enthaltenden Gruppen B2, D und F ge-lang bei 43 (13,5 %) Isolaten. Diese konnten Sequenztypen zugeordnet werden (ST131, ST405, ST648), die maßgeblich an der globalen Ausbreitung von ESBL-Genen beim Men-schen beteiligt sind. Der Nachweis zahlreicher ExPEC-assoziierter VAGs lässt zudem auf ein mögliches pathogenes Potential dieser Isolate schließen. Auch bei den ESBL-bildenden Kp-Isolaten dominierte mit dem ST15 eine in der Humanmedizin weit verbreitete klonale Linie von großer klinischer Relevanz.
In dieser Arbeit konnten erstmals CP-bildende Enterobacteriaceae bei Hobbytieren nachge-wiesen werden. Fünf Ec- und 35 Kp-Isolate sowie ein Ko-Isolat von zwei Katzen und 31 Hunden wiesen ein in der Humanmedizin weltweit verbreitetes, ca. 60 kDa großes, transkon-jugierbares OXA-48-Plasmid vom Replikontyp IncL auf. Unter den OXA-48-bildenden Ec-Isolaten besaßen 80 % zusätzlich ESBL-/AmpC- und PMQR-Gene, dies war bei 69,4 % res-pektive 97,2 % der Klebsiella spp.-Isolate der Fall. Von den fünf OXA-48-bildenden Ec-Isolaten gehörten drei zum ST1196 und jeweils ein Isolat zum ST1431 bzw. ST410. Unter den OXA-48-bildenden Kp-Isolaten dominierten der ST15 (n=25; 71,4 %) und der ST11 (n=9; 25,7 %). Da alle CP-bildenden Isolate von Tieren aus einer Tierklinik stammten, die OXA-48-Plasmide eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen und jeweils identische Pulsfeldgelelektrophorese-Typen unter den Ec-ST1196-, Kp-ST15- und Kp-ST11-Isolaten gefunden wurden, musste, ähnlich wie bereits für Krankenhäuser in Deutschland und anderen Ländern beschrieben, eine nosokomiale Ausbreitung des Plasmids bzw. seiner bakteriellen Träger angenommen werden. Aufgrund heterogener Untersuchungsergebnisse konnte ein Einfluss des OXA-48-Plasmids auf die Biofilmbildung der Bakterien und somit auf die mögliche Ausbreitung der tragenden Bakterien im klinischen Umfeld nicht abschließend bewertet werden.
Diese Arbeit konnte zeigen, dass Tiere nicht nur Träger von ESBL/-AmpC- sondern auch von CP-bildenden Enterobacteriaceae sind. Der Nachweis von Sequenz- und Plasmidtypen, die in der Humanmedizin eine bedeutsame Rolle spielen, weist auf eine insbesondere zwischen Hobbytier und Mensch zu vermutenden Übertragung von multiresistenten Bakterien hin, de-ren Ausmaß und Richtung dringend weiterer Untersuchungen im Sinne eines „One-Health“-Ansatzes bedarf. Gezielte Überwachungsprogramme sind notwendig, um die nosokomiale Ausbreitung multiresistenter Bakterien in Tierkliniken zu identifizieren und interventive Hygi-enemaßnahmen zu implementieren.
Kurzfassung auf Englisch: The global spread of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) and carbapenemase (CP)-producing Enterobacteriaceae is currently one of the biggest challenges for public health. Animals are often described as source of ESBL-producing bacteria, whereas their relevance in carrying and transmitting CP-producing bacteria is largely unexplored. Therefore, the aim of this work was to characterize ESBL/CP-producing Escherichia coli (Ec) and Klebsiella (K.) spp.-isolates of companion and livestock (cattle/pig) animals. In order to compare resistance types and international clones known to prevail in humans, ESBL/CP variants and Ec/K. pneumoniae (Kp) sequence types were determined. The analysis of virulence-associated genes (VAGs) linked with extraintestinal pathogenic Ec (ExPEC) and intestinal pathogenic Ec was performed to assign Ec isolates to pathotypes. Finally, the extent to which a resistance plasmid influences the bacterial biofilm formation was examined.
In the period from June 2012 to February 2014 3582 Ec-, 457 Kp- and 132 K. oxytoca (Ko) isolates from bacteriological specimens mainly taken from diseased livestock and companion animals and received from > 400 veterinary practices/clinics, were examined. A total of 280 Ec-, 44 Kp- and 5 Ko-isolates could be confirmed as ESBL-producers. In addition, 38 and 11 AmpC-β-lactamase (AmpC)-producing Ec- and Klebsiella spp. isolates were identified. ESBL-/AmpC-producing Ec isolates were most common in cattle (17.4 %) and dogs (11.1 %). ESBL-producing Klebsiella spp. isolates were most frequently detected in dogs (22.3 %), but they were significantly less frequent in livestock animals (cattle: 2.6 %, pig: 1.6 %). AmpC-producing Klebsiella spp. isolates were only present in dogs. The highest rate of ESBL/AmpC carriage was present in wounds, which were exclusively derived from companion animals (Ec: 22.1 %, Klebsiella spp., 60.0 %), followed by isolates from urine, skin/hair samples, and from feces.
The most common ESBL type in Ec was CTX-M-1 (58.9 %), followed by CTX-M-15 (23.9 %), CTX-M-14 (6.4 %), SHV-12 (6.1 %), and CTX-M-3 (1.8 %). CTX-M-1 was particularly present in livestock (dog and cat: cattle: 17 %, pig 52.7 %, dog and cat: 14.5 %) whereas CTX-M-15, which is widely distributed in humans, mainly occurred in companion animals (cattle: 16.4 %, pig: 14.9 %, dog and cat: 44.8 %). SHV-12 appeared almost exclusively in companion animals. CTX-M-15 (71.4 %) predominated in the ESBL-producing Klebsiella spp. isolates. The most common AmpC in the Ec isolates was CMY-2 (n = 29); DHA-1 and ACC-4 were detected only once. Among the Klebsiella spp. isolates, the AmpC DHA-1 (28 %) dominated. For 12 of the 38 AmpC-producing Ec isolates a mutation in the AmpC promoter region could be detected, which typically causes hyperproduction of AmpC. Almost all ESBL-/AmpC-producing Klebsiella spp. isolates and 21.7 % of the Ec isolates harbored at least one of the fluoroquinolone resistance genes qnr, oqxA/B, and aac (6´) -Ib-cr.
Eight (8.2 %, 8/97) ESBL-producing intestinal Ec isolates of pigs were identified as enterotoxic Ec (ETEC), two as atypical enteropathogenic Ec (aEPEC). A large proportion of the ESBL-/AmpC-producing Ec isolates were assigned to phylogroups A (41.5 %) and B1 (24.8 %). Fourty-three (13.5 %) isolates were classified into groups B2, D and F, which typically represent ExPEC. These isolates could be assigned to sequence types (ST131, ST405, ST648), which have been identified as major players in the global dissemination of ESBL genes in humans. The detection of numerous ExPEC-associated VAGs also suggests a pos-sible pathogenic potential of these isolates. Also in case of the ESBL-producing Kp isolates identified in this study, a clonal lineage of high clinical relevance and wide distribution in hu-man medicine, namely ST15, was predominant.
In this work CP-producing Enterobacteriaceae could be identified in companion animals for the first time. Five Ec and 35 Kp isolates, derived from two cats and 31 dogs, possessed a 60 kDa, transconjugative OXA-48 plasmid of the Replicon type IncL, which is widely distributed in humans. Among the OXA-48-producing Ec isolates, 80 % additionally harbored ESBL/AmpC and PMQR genes; this was also the case for 69.4 % and 97.2 % of the Klebsiella spp. isolates, respectively. Three of the five OXA-48-producing Ec isolates be-longed to ST1196 and one isolate to ST1431 and ST410, respectively. Among the OXA-48-producing Kp isolates ST15 (n = 25; 71.4 %) and ST11 (n = 9; 25.7 %) were predominant.
Due to a common origin of the CP-producing isolates from animals in the same veterinary clinic, the high similarity of OXA-48 plasmids and the presence of identical pulsed-field gel electrophoresis types among the Ec-ST1196, Kp-ST15 and Kp-ST11 isolates, a nosocomial spread of the plasmid or its bacterial hosts, similar to what has already been described for hospitals in Germany and other countries, had to be supposed. As biofilm experiments yielded quite heterogenous results, a definite influence of the OXA-48 plasmid on the biofilm forming capacity of bacteria could not be conclusively clarified.
This work could show that animals are not only carriers of ESBL-/AmpC- but also of CP-producing Enterobacteriaceae. The detection of sequence types and plasmid types that play a significant role in human medicine, hints towards a possible transmission of multiresistant bacteria, particularly between companion animals and humans. The extent of transfer and its direction urgently requires further investigations in terms of the "One-Health" approach. Sys-tematic monitoring programs are needed to identify the nosocomial spread of multiresistant bacteria in animal clinics and to implement interventive hygiene measures.
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