Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Untersuchungen des cytoplasmatischen Phytochrom-Signalwegs in Physcomitrella patens durch Charakterisierung von Phytochrom 4 Interaktionspartnern

Investigation of phytochrome cytoplasmic signalling in Physcomitrella patens by characterisation of phytochrome 4 interacting partners

Ermert, Anna Lena


Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (19.848 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-123973
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12397/

Bookmark bei del.icio.us


Freie Schlagwörter (Deutsch): Phytochrom , Signaltransduktion , Phototropin , Physcomitrella patens , Hefe-Zwei-Hybrid
Freie Schlagwörter (Englisch): phytochrome , signal transduction , phototropin , Physcomitrella patens , yeast two-hybrid
Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Institut f√ľr Pflanzenphysiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 07.12.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 22.12.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Phytochrome sind Rotlicht-/Dunkelrotlicht (R/FR)-revertierbare Photorezeptoren, die eine zentrale Rolle in der Licht-regulierten pflanzlichen Entwicklung spielen. Der aktivierte Rezeptor transloziert in den Zellkern, interagiert dort mit diversen Signaltransduktions-Komponenten, was zu differenzieller Genregulation f√ľhrt. Verschiedene Evidenzen belegen allerdings zweifelsfrei, dass es zus√§tzlich einen Phytochrom-Signalweg im Cytoplasma gibt. Beispielsweise werden Rotlicht-Phototropismus und -polarotropismus im Laubmoos Physcomitrella patens durch Phytochrom (haupts√§chlich phy4) vermittelt, was eine Genregulations-basierte Signaltransduktion ausschlie√üt, da die Richtungsinformation dabei zwangsl√§ufig verloren geht. Das Richtungssignal wird an das Aktin-Cytoskelett weitergeleitet, welches w√§hrend der Reaktion massiv umorganisiert wird und somit als Effektor der polaren Wachstumsantwort gilt. In einem vorherigen Dissertationsprojekt konnte mittels Yeast-Two-Hybrid (Y2H)- und Split-YFP-Methoden eine R-induzierte bzw. in planta Interaktion von phy4 mit dem Blaulichtrezeptor Phototropin an der Plasmamembran (PM) demonstriert werden. Der gest√∂rte R-Photo- und Polarotropismus einer Phototropin-Triple-Mutante belegt die physiologische Relevanz der Photorezeptor-Co-Aktion. In dieser Arbeit wurde ein ex vivo Co-Immunopr√§zipitations-Assay etabliert und erfolgreich angewendet, um die Interaktion mit einer unabh√§ngigen Methode zu demonstrieren.
Der Fokus der Doktorarbeit lag auf der Identifikation und Charakterisierung von phy4-Interaktionspartnern, die am cytoplasmatischen phy4-Signalweg beteiligt sein k√∂nnten. Dazu wurde ein Y2H-cDNA-Library Screen mit photoaktivem Volll√§ngen-Holophytochrom als Bait durchgef√ľhrt und in R selektiert, um vorwiegend Pfr-spezifische Interaktoren zu erfassen. 70 von 4 x 105 gescreenten Hefeklonen konnten dabei isoliert und nach Sequenzierung in silico bzgl. funktioneller Dom√§nen und Homologen in anderen Pflanzen analysiert werden. Nach Eliminierung identischer Sequenzen verblieben 60 Kandidaten plus vier Weitere aus einem vorhergehenden Screen, denen auf Basis der in silico Analysen und umfangreicher Literaturrecherche m√∂gliche Funktionen zugeordnet wurden. Etwa zwei Drittel der Kandidaten konnten ausgeschlossen werden, da sie wahrscheinlich Metabolismus-, Transkriptions/Translations-, Stress- oder Phytohormon-assoziierte Funktionen aus√ľben und daher f√ľr cytoplasmatisches Phytochrom-Signalling von geringerer Relevanz sind. Ausnahmen bilden hier der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF-5A) und Elongationsfaktor 1alpha (EF1alpha), die wohl duale Funktionen in Translation und Cytoskelett-Organisation im Cytoplasma haben. Interessanterweise hat ein Drittel der Interaktoren m√∂gliche Funktionen in Signaltransduktion oder posttranslationaler Modifikation, Cytoskelett-Assoziation oder als Membranproteine. Die recht gro√üe Gruppe der Signaltransduktions-Proteine ist divers und enth√§lt klassische Signalproteine (z.B. ein Pirin und ein 14-3-3 Protein), Proteine mit Protein-Protein-Interaktionsdom√§nen (PRL1 mit WD40-Dom√§ne, ein Zinkfinger (ZF)- und ein Kelch-Repeat-Protein) und Enzyme (diverse (Ca2+-abh√§ngige) Ser/Thr-Kinasen, und ein P-Loop-Protein mit Sulfotransferase-Dom√§ne). Insgesamt wurden 19 Kandidaten ausgew√§hlt und zun√§chst als Volll√§ngen CDS aus Physcomitrella cDNA amplifiziert um saubere Prey-Konstrukte herzustellen. Diese wurden anschlie√üend mit Holo-phy4-Baits in einem semiquantitativem Y2H-Wachstums-Assay kombiniert und in Dunkelheit (D), kontinuierlichem R (Rc) bzw. gepulstem R (Rp) bzw. in Rp + FRp selektiert. Dabei konnten 18 putative Interaktionspartner verifiziert werden. Meist fand R-induziertes oder R-verst√§rktes und FR-revertierbares Wachstumsverhalten statt, so dass entsprechende Interaktoren als Holophytochrome Interacting Proteins (HIPs) bezeichnet wurden. In planta Expression von HIP-Fluoreszenzprotein-Fusionen und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung ohne bzw. mit R-Vorbehandlung zeigte, dass alle analysierten HIPs eine cytoplasmatische und ggf. zus√§tzlich eine nukle√§re Lokalisation aufwiesen. Somit sind diese HIPs vermutlich in diesen Kompartimenten funktional. Es konnte in keinem Fall eine differentielle Lokalisation nach R beobachtet werden. Split-YFP-Analysen in D und R konnten in der Tat 12 HIPs auch in planta als phy4 Interaktoren best√§tigen. Die HIP-phy4-Interaktionen fanden in der Regel in Cytoplasma und ggf. zus√§tzlich im Kern statt, wobei 14-3-3/HIP14, EF1alpha/HIP13 und eIF-5A/HIP12 ein Cytoskelett-√§hnliches Interaktionsmuster aufwiesen. Das ZF-Protein (HIP3), eine putative Ser/Thr-Proteinkinase (HIP7) und eine putative Intramembran-Serin-Protease (HIP9) interagierten ausschlie√ülich nach R mit phy4, was f√ľr eine Pfr-spezifische Interaktion und ggf. phy4-induzierte Aktivierung sprechen k√∂nnte. Zuk√ľnftig werden physiologische Untersuchungen von HIP-Knockouts Aufschluss √ľber die physiologische Relevanz der HIPs im Phytochrom-Signaltransduktionsweg geben.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand