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Die Wirkung von luminal appliziertem Acetylcholin auf den Ionentransport im Trachealepithel des Schweins

Dittrich, Nikolaus Paul


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-123303
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12330/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): CFTR , Cl-Sekretion , non-neuronales Acetylcholin , Schweine-Trachealepithel , transepithelialer Ionentransport
Freie Schlagwörter (Englisch): CFTR , Cl- secretion , non-neuronal acetylcholine , pig tracheal epithelium , transepithelial ion transport
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierphysiologie, AG Molekulare Zellphysiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.09.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 08.11.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Einleitung: In den Atemwegen von Mäusen konnte gezeigt werden, dass Acetylcholin (ACh) als ein autokrines/parakrines Signalmolekül in die Atemwegsflüssigkeit entlassenen wird und dort nikotinerge und muskarinerge ACh-Rezeptoren (n- und mAChR) aktiviert, die eine Cl–-Sekretion über Ca2+-abhängige Cl–- und K+ -Kanäle vermitteln sollen. Schweine werden, im Vergleich zum Mausmodell, verstärkt als ein geeignetes Modell zur Untersu-chung menschlicher Atemwegserkrankungen angesehen, die mit einem gestörten epithelia-len Ionentransport verbunden sind (z.B. Mukoviszidose, COPD). Aus diesem Grund wurden in Atemwegsepithelien von Schweinen (i) die Pharmakologie von luminal appliziertem ACh, (ii) die intrazelluläre Ca2+-Abhängigkeit des Effekts von luminal appliziertem ACh und (iii) die Regulierung des transepithelialen Ionentransports durch luminal appliziertes ACh untersucht.
Methode: Trachealpräparationen von Schweinen wurden in Ussing-Kammern eingesetzt, um die transepithelialen Ionentransport-Prozesse elektrophysiologisch als Kurzschlussstrom (ISC) zu messen.
Ergebnisse: Luminal appliziertes ACh induzierte eine transiente Erhöhung des ISC. Dieser Effekt konnte durch den unspezifischen ACh-Rezeptor-Agonisten Carbachol und die mAChR-Agonisten Muskarin und Pilokarpin nachgeahmt werden. Weiterhin wurde der ACh-induzierte Anstieg des ISC durch den nicht-selektiven mAChR-Antagonisten Atropin (M1-5AChR) größtenteils geblockt. Weitere Experimente mit dem M1AChR-Antagonisten Pirenzepin und dem M3AChR-Antagonisten 4-DAMP resultierten in einer dosisabhängigen Hemmung des ACh-induzierten ISC (IC50 von 69.1 µM bzw. 49.3 nM). Im Vergleich zu den muskarinergen Agonisten waren der nAChR-Agonist Nikotin und der membranundurchläs-sige nAChR-Agonist DMPP nicht in der Lage, den ACh-induzierten ISC zu verändern. Zu-sätzlich wurden in Gegenwart von Nikotin und dem nicht-selektiven nAChR-Antagonisten Mecamylamin keine Veränderungen im ACh-induzierten ISC registriert.
Weiterhin wurde eine potentielle Beteiligung von Ca2+ am Effekt von luminal appliziertem ACh untersucht. Eine Entfernung von extrazellulärem Ca2+ aus der Ringerlösung hatte kei-nen Einfluss auf den ACh-induzierten ISC. In Experimenten, bei denen intrazelluläre sar-ko/endoplasmatische Ca2+-ATPasen mit drei Inhibitoren (Thapsigargin, DTBHQ und Cyc-lopiazonsäure) gehemmt wurden, war nur Thapsigargin in der Lage, den ACh-induzierten ISC zu inhibieren. Weiterhin konnte in Gegenwart des Inositol-1,4,5-triphosphat-Rezeptor (IP3R)-Inhibitors 2-APB und des Ryanodin-Rezeptor (RyR)-Inhibitors Rutheniumrot keine Veränderung des ACh-induzierten ISC beobachtet werden. Zudem zeigte ein Inhibitor der Phosphatidylinositol-Phospholipase C (U73122) keine Auswirkung auf den ACh-induzierten ISC, während ein Phosphatidylcholin-Phospholipase C-Inhibitor (D609) diesen reduzierte. Des Weiteren wurde ein cAMP-abhängiger Signalweg durch die Verwendung eines Ade-nylylcyclase-Inhibitors (MDL) ausgeschlossen.Bei den Untersuchungen zur Regulierung des transepithelialen Ionentransports durch lumi-nal appliziertem ACh, konnte mit den Kanalblockern für die Cl– sekretierenden Ionenkanäle CFTR (GlyH101) und CaCC (Tanninsäure) kein Einfluss auf den ACh-induzierten ISC festge-stellt werden. Im Gegensatz dazu führte eine Depolarisation der basolateralen Membran mit einer hohen K+-Konzentration zu einer Inhibition des ACh-induzierten ISC. Allerdings konnte mit dem allgemeinen K+-Kanalblocker Ba2+ keine Inhibition des ACh-induzierten ISC erzielt werden. Weiterhin waren verschiedene Kanalblocker für big conductance (BK-), intermediate conductance (IK-) und small conductance (SK-) Ca2+-aktivierte K+-Kanäle nicht in der Lage, den ACh-induzierten ISC zu inhibieren.
Fazit: Luminal appliziertes ACh stimuliert M1AChR- und M3AChR-Subtypen (bevorzugt den M3AChR-Subtyp) in den Atemwegsepithelzellen des Schweins. Interessanterweise wur-de keine Beteiligung von nAChR beobachtet. Des Weiteren wurden keine klaren Hinweise für eine potentielle Beteiligung einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration in-folge von luminal appliziertem ACh gefunden. Überdies wird durch luminal appliziertes ACh, mit der Ausnahme einer K+-Leitfähigkeit in der basolateralen Membran, keine weitere Ionenkanalaktivität beeinträchtigt; einschließlich einer apikalen Cl–Leitfähigkeit. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass in den Atemwegen von Schweinen und Mäusen beträchtliche Unterschiede in den cholinergen Signalwegen vorliegen.
Kurzfassung auf Englisch: Introduction: In murine airways it was shown that acetylcholine (ACh) can be released into the airway lining fluid to act as an auto-/paracrine signaling molecule by activating nicotinic and muscarinic ACh receptors (n- and mAChR) which are assumed to trigger Cl–- secretion via Ca2+-dependent Cl–- and K+ channels. Compared to mice, pigs represent a suitable model to study human airway diseases which are associated with impaired airway epithelial ion transport processes (e.g. cystic fibrosis, COPD). Therefore, the present study investigated (i) the pharmacology of luminally applied ACh, (ii) the intracellular Ca2+ dependence of lu-minally applied ACh and (iii) the regulation of ion transport processes across porcine airway epithelia by luminally applied ACh.
Method: Porcine tracheal preparations were mounted in Ussing-chambers and ion transport processes were measured electrophysiologically as short-circuit-current (ISC) signals.
Results: Luminally applied ACh induced a transient increase in ISC. The action of luminally applied ACh was mimicked by the cholinergic receptor agonist carbachol and by the mAChR agonists muscarine and pilocarpine. The ACh-induced ISC was largely blocked by the non-selective mAChR antagonist atropine (M1-5AChR). The M1AChR-preferring an-tagonist pirenzepine, as well as the M3AChR-preferring antagonist 4-DAMP dose-dependently inhibited the ACh-induced ISC (IC50 of 69.1 µM and 49.3 nM, respectively). In contrast to the action of muscarinic agonists, the nAChR agonist nicotine and the mem-brane-impermeable nAChR agonist DMPP failed to increase the ISC. Furthermore, the ACh-induced ISC was not altered in the presence of nicotine or the non-selective nAChR-antagonist mecamylamine.In further experiments a potential contribution of Ca2+ was investigated. Removal of extra-cellular Ca2+ from the Ringer solution did not affect the ACh-induced ISC. In experiments where intracellular sarco/endoplasmic Ca2+-ATPases were blocked with three inhibitors (thapsigargin, DTBHQ and cyclopiazonic acid), exclusively thapsigargin was able to inhibit the ACh-induced ISC. Furthermore, there was no change in the ACh-induced ISC in the pres-ence of the inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor inhibitor 2-APB and the ryanodine receptor (RyR) inhibitor ruthenium red. An inhibitor of phosphatidylinositol-phospholipase C (U73122) was without any effect on the luminal ACh-induced ISC which was, in contrast, attenuated by a phosphatidylcholine-phospholipase C inhibitor (D609). A cAMP-sensitive pathway was also excluded by using an inhibitor of adenylyl cyclase (MDL). It was also investigated which transport pathways contribute to the ACh-induced ISC. Chan-nel blockers of Cl– secreting ion channels CFTR (GlyH101) and CaCC (tannic acid) did not affect the ACh-induced ISC. By contrast, depolarization of the basolateral membrane by a high K+ concentration decreased the ACh-stimulated ISC. However, the broad spectrum K+ channel blocker Ba2+ was ineffective to block the ACh-induced ISC. In addition, different channel blockers for big conductance (BK), intermediate conductance (IK) and small con-ductance (SK) Ca2+-activated K+ channels also did not block the ACh-induced ISC.
Conclusion: Luminally applied ACh stimulates M1AChR and M3AChR subtypes (preferen-tially the M3AChR subtype) in porcine airway epithelium. Interestingly, there is no partici-pation of nAChR and there is no clear evidence for a potential contribution of an increase in intracellular Ca2+ due to luminally applied ACh. Furthermore, with the exception of a K+ channel conductance in the basolateral membrane, no other ion channel activity, including apical Cl– channel conductance, is affected by luminally applied ACh. These results indicate considerable differences in cholinergic signaling pathways in the airways of pigs compared to mice airways.
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