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Morphologische Untersuchung AAV-transduzierter Retinae nach subretinaler Injektion in Ratten

Giers, Bert Constantin


Originalveröffentlichung: (2016) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (11.958 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-121182
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12118/


Universität Justus-Liebig-UniversitĂ€t Gießen
Institut: Klinik und Poliklinik fĂŒr Augenheilkunde
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6345-0
Sprache: Deutsch
Tag der mĂŒndlichen PrĂŒfung: 27.04.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 21.06.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel: Beurteilung der Effekte der subretinalen Injektion, des AAV-vermittelten Gentransfers und der GFP-Expression in Photorezeptoren auf die Morphologie der Retina und den Apoptose-Status retinaler Zellen in Ratten, denen entweder eine Fluoreszein-Lösung oder ein AAV2/5-Vektor mit dem GFP-Gen unter einem CMV-Promoter subretinal injiziert wurde.
Methoden: Untersuchung der Morphologie der Ă€ußeren Körnerschicht mittels immuncytochemischer Markierung zellulĂ€rer Zielstrukturen und konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie sowie Transmissionselektronenmikroskopie; Quantifikation der Synapsen in der OPL; Beurteilung des Gliose-Status; TUNEL-Assay.
Ergebnisse: Trotz der hohen PlastizitĂ€t synaptischer Strukturen vor allem in der Ă€ußeren plexiformen Schicht, die auf verschiedentlich verursachte Degenerationen und Verletzungen mit typischen Reaktionsmustern, wie VerkĂŒrzung und RĂŒckzug der StĂ€bchen-Endknöpfchen, Aussprossungen dendritischer FortsĂ€tze von Horizontal- und Bipolarzellen sowie Bildung ektoper Synapsen reagieren, konnten in dieser Studie keine histologischen VerĂ€nderungen festgestellt werden. Sowohl bei Fluoreszein-injizierten als auch bei GFP-transduzierten Retinae zeigte sich die Ă€ußere plexiforme Schicht strukturell normal organisiert und es fanden sich keine Anzeichen fĂŒr eine VerkĂŒrzung und einen RĂŒckzug der StĂ€bchen-Terminalien. Horizontal- und StĂ€bchen-Bipolarzellen wiesen keinen Verlust dendritischer Endigungen auf und insbesondere zeigten sich keine Aussprossungen von ZellfortsĂ€tzen in die Ă€ußere Körnerschicht. Auch auf ultrastruktureller Ebene zeigten sich Zapfen-FĂŒĂŸchen und StĂ€bchen-Terminalien unverĂ€ndert. Die Anzahl synaptischer Kontakte zwischen StĂ€bchen und StĂ€bchen-Bipolarzellen war nicht reduziert. Obwohl die durch die subretinale Injektion verursachte vorĂŒbergehende Netzhautablösung zu einer verstĂ€rkten GFAP-Expression in den MĂŒller-Zellen fĂŒhrt, fanden sich keine Anzeichen fĂŒr eine schwerere Gliose. In behandelten NetzhĂ€uten tritt kein vermehrter Zelltod durch Apoptose auf.
Schlussfolgerungen: Der AAV-vermittelte Gentransfer und die Expression des GFP-Transgens in den Photorezeptoren fĂŒhren weder zu morphologischen VerĂ€nderungen der Netzhaut noch zu einer erhöhten Apoptoserate. Es handelt sich somit um einen sicheren und effizienten Weg zur Einbringung eines Transgens in Zellen der Ă€ußeren Retina.
Kurzfassung auf Englisch: Purpose: To determine the effects of vector-delivery via subretinal injection, AAV-mediated gene-transfer to photoreceptors and GFP-expression within photoreceptors on retinal morphology and apoptotic status of retinal cells in rats that underwent subretinal injection of either fluorescein or an AAV2/5 vector containing the GFP-gene under control of a CMV promoter.
Methods: Assessment of outer-plexiform-layer morphology by means of immunocytochemical labeling and laser scanning confocal microscopy as well as electron microscopy; quantification of OPL synapses; assessment of retinal gliosis; TUNEL-Assay.
Results: In spite of the high plasticity of the retinal circuitry especially within the outer plexiform layer, where rod spherule retraction, dendritic sprouting and the formation of ectopic synapses between photoreceptors and second order neurons have been shown to be common responses to different types of retinal degeneration and retinal injury, no histologic abnormalities have been found in our study. The outer plexiform layers in both fluorescein-injected and GFP-transduced retinae showed a normal architecture and there were no signs of rod spherule retraction. No dendritic pruning was found in rod bipolar or horizontal cells and particularly no sprouting of second order neurite processes into the outer nuclear layer could be observed. Both rod spherules and cone pedicles and their respective invaginating and flat synaptic contacts seemed unaltered on an ultrastructural level. The overall number of synaptic contacts between rods and rod bipolar cells did not appear to be reduced. Although the temporary retinal detachment caused by the subretinal injection results in an upregulation of glial fibrillary acidic protein expression within retinal MĂŒller cells, there were no signs of more severe forms of gliosis. There is no increase in apoptotic cell death within treated retinae.
Conclusions: AAV-mediated transgene delivery via subretinal injection and expression of GFP as a transgene in photoreceptors do not inflict significant changes on retinal morphology nor do they lead to increased rates of apoptotic cell death. It seems therefore to be a safe and efficacious way for transgene delivery to outer retinal cells.
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