Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Detection and characterization of lipopeptide-specific T cells in guinea pigs sensitized with bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex

Kaufmann, Eva


Originalveröffentlichung: (2016) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (9.241 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-121033
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12103/

Bookmark bei del.icio.us


Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere; Paul-Ehrlich-Institut Langen
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6442-6
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 13.06.2016
Kurzfassung auf Englisch: The only available vaccine against TB – the Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccine – provides reliable protection against severe manifestations of childhood TB, but not against pulmonary tuberculosis in adults. Despite many attempts, no improved alternative TB vaccine has been fully licensed so far. It may be crucial for future vaccine development to gain further knowledge on the stimulatory antigens of this vaccine strain and their elicited immune responses.
The aim of the current study was to investigate the BCG-mediated adaptive immune responses directed against lipid preparations (chloroform-methanol extracts, CMEs) of bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). To this end, the BCG-sensitized guinea pig was employed as a model for human BCG vaccination. In particular, the present study addressed whether lipopeptides in the CME preparations constitute relevant stimulatory antigens for adaptive cellular immune responses upon BCG sensitization and whether the expression of stimulatory lipid antigens varies across the genus Mycobacterium. It was further attempted to identify the molecular nature of the stimulatory antigens present in CME.
Outbred Dunkin-Hartley guinea pigs were sensitized with BCG or, for comparison purposes, with heat-inactivated wet mass of the virulent M. bovis strain AN5. Ex vivo, the proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was investigated in a CFSE-based proliferation assay which was subsequently analyzed by flow cytometry. In this assay, CMEs of M. bovis BCG and M. tuberculosis H37Rv and, in addition, a Koch’s “Old Tuberculin” standard were used as antigenic stimuli. The molecular nature of the relevant stimulatory antigens within these preparations was investigated by means of delipidation and protease treatment. Furthermore, the stimulatory potentials of a lipopeptide-enriched subfraction of CME(H37Rv) (LppEL), of a defined mycobacterial protein antigen (AG85A), and of different BCG preparations (live or heat-inactivated bacteria, bacterial lysates derived from BCG cultures in the exponential as well as in the static growth phase, and culture supernatant) were tested for their stimulatory potentials in the ex vivo lymphocyte proliferation assay. A restimulation assay based on the antigen-specific expansion of ex vivo lymphocytes, the sorting for expanded lymphocytes and the restimulation of these cells, was established in this study and served subsequently for determination of the antigen-specificity of the stimulated lymphocytes as well as for investigating the distribution of the stimulatory antigens among the tested preparations (Tuberculin, CME(BCG), CME(H37Rv), LppEL). The distribution of the stimulatory antigens was further analyzed among the genus Mycobacterium using CMEs of several MTC strains, including clinical ones, (M. bovis AN5, M. tuberculosis CDC 1551, Haarlem 2336, HN 878, Beijing 1934, East African-Indian strains 1797 and 91/0079, M. canetti) and of non-tuberculous mycobacteria (NTM) (M. marinum, M. avium ssp. avium and M. avium ssp. paratuberculosis, M. leprae, M. fortuitum). It was attempted to identify the molecular nature of the stimulatory antigens in the lipid preparations by two complementary approaches: the purification of lipopeptides from enriched antigen preparations by means of reversed phase chromatography and the investigation of the stimulatory potentials of synthetic, N-terminal peptides of M. tuberculosis lipoproteins.
Flowcytometric analysis of the ex vivo lymphocyte proliferation assay revealed that guinea pigs mount strong, adaptive lymphocyte responses upon sensitization with both BCG and inactivated, virulent M. bovis AN5. The lymphocytes proliferated upon stimulation with CME preparations of M. bovis BCG and M. tuberculosis H37Rv. The CME(BCG)-stimulated proliferation manifested in a similar range as lymphocyte responses elicited by tuberculin with the median proliferation being represented by ~ 45 % CFSE-low lymphocytes in BCG-sensitized guinea pigs. This proliferation was significantly stronger than the lymphocyte responses to the defined mycobacterial protein antigen AG85A (p ≤ 0.0001, student’s t test). The above-mentioned preparations of BCG bacteria, however, stimulated strong proliferation as well (significantly above 20 % CFSElow cells, p ≤ 0.001, one-sample t test). The CME(BCG)-responding lymphocytes were predominantly (~ 83 %) CD4-positive T cells. Delipidation as well as protease treatment of CME(BCG) decreased the stimulatory capacities significantly (p ≤ 0.0001, student’s t test) to median levels below 20 % CFSE-low cells. The same effect on the ex vivo lymphocyte proliferation was observed upon delipidation as well as proteinase K treatment of tuberculin. Furthermore, when stimulating the ex vivo PBMCs with a lipopeptide-enriched subfraction of CME(H37Rv) (LppEL), the median lymphocyte proliferation manifested similar to the lymphocyte response to the parental CME(H37Rv) preparation and both proliferative responses were positively correlated (r = 0.64, Spearman correlation). Using the restimulation assay, it could be confirmed that the proliferated T cells responded specifically to antigens present in tuberculin, CME(BCG) and CME(H37Rv), as well as in LppEL. Strong proliferative responses (on average significantly above 20 % CFSE-low cells, p ≤ 0.05, one-sample t test) were, however, only observed in response to CME preparations of MTC bacteria. In contrast, the average proliferative response to CME preparations of NTM did not exceed the 20 % cut-off significantly (p > 0.05). So far, it was not possible to identify single lipopeptides which accounted for the observed, strong lymphocyte proliferation. However, it is remarkable that some synthetic N-terminal peptides of M. tuberculosis lipoproteins (LprG, PstS3, LppW, LprL, Pitlp, and LppD) stimulated stronger lymphocyte proliferation on average in the group or in individual guinea pigs.
The results demonstrate that the guinea pig is well-suited to investigate adaptive immune responses elicited by MTC bacteria and, in particular, it is a good model to investigate BCG vaccination in a defined experimental setting. All findings were in full accordance with the observations in M. tuberculosis-infected humans. Strong evidence for the stimulatory potential and the relevance of lipopeptides in CME preparations was provided by three independent immunological approaches. Moreover, it could be demonstrated that lipopeptides account for a majority of the stimulatory capacities not only of CME, but also of Koch’s Old Tuberculin. The extensive expression and the release of strong antigens, such as the putative lipopeptides, by BCG is supported by the data. Furthermore, the putative stimulatory lipopeptides must be specifically expressed or cross-recognized within the Mycobacterium tuberculosis complex, but only rarely in non-tuberculous mycobacteria. However, the identification of single strong lipopeptide antigens requires further investigation. In this line, it must be considered that antigen mixtures of several single, strong lipopeptide antigens, whose existence has been suggested by the present results, might be necessary to elicit similar strong lymphocyte responses as observed upon stimulation with complex, lipopeptide-containing antigen mixtures such as CME.
Kurzfassung auf Deutsch: Der einzige, verfügbare Impfstoff gegen Tuberkulose – der Bacille Calmette-Guérin (BCG)- Impfstoff – schützt verlässlich vor schweren Formen der Tuberkulose im Kindesalter, aber nicht vor Lungentuberkulose bei Erwachsenen. Trotz vieler Versuche konnte bisher noch kein verbesserter, alternativer TB-Impfstoff zugelassen werden. Für die zukünftige Impfstoff- entwicklung kann der weitere Erkenntnisgewinn über die stimulatorischen Antigene dieses Impfstammes und die durch sie hervorgerufenen Immunantworten entscheidend sein.
Das Ziel der hier beschriebenen Studie war die Untersuchung der BCG-vermittelten adaptiven Immunantwort, die sich gegen Lipidpräparationen (Chloroform-Methanol-Extrakte, CME) von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes (MTC) richtet. Mit BCG sensibilisierte Meerschweinchen wurden als Modell für die BCG-Impfung im Menschen eingesetzt. Die hier vorliegende Studie befasst sich im Speziellen mit der Frage, ob Lipopeptide in CME-Präparationen relevante stimulatorische Antigene für die adaptive, zelluläre Immunantwort nach BCG-Impfung darstellen und ob die Expression von stimulatorischen Lipidantigenen innerhalb des Genus Mycobacterium variiert. Eine weitere Intention war, die molekulare Struktur der stimulatorischen Antigene in CME zu identifizieren.
Auszucht-Dunkin-Hartley-Meerschweinchen wurden mit BCG oder – zu Vergleichszwecken – mit hitze-inaktivierter Feuchtmasse des virulenten M. bovis-Stamms AN5 sensibilisiert. Die ex vivo Proliferation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) wurde in einem auf CFSE-Färbung basierenden Proliferations- assay untersucht, der mittels Durchflusszytometrie analysiert wurde. In diesem Assay wurden CMEs von M. bovis BCG und M. tuberculosis H37Rv sowie zusätzlich ein Kochscher Alttuberkulin-Standard als antigene Stimuli verwendet. Die Untersuchung der molekularen Struktur der relevanten, stimulatorischen Antigene in diesen Präparationen erfolgte mit Hilfe von Delipidierung und Protease-Behandlung. Darüber hinaus wurden die stimulatorischen Potenziale von einer Lipopeptid-angereicherten CME(H37Rv)-Subfraktion (LppEL), einem definierten, mykobakteriellen Protein-Antigen (AG85A) und verschiedenen BCG-Präparationen (lebende oder Hitze-inaktivierte Bakterien, bakterielle Lysate von BCG-Kulturen in der exponentiellen als auch in der statischen Wachstumsphase, Kulturüberstand) im ex vivo-Lymphozytenproliferationsassay getestet. Ein Restimulationsassay, der auf der antigen-spezifischen Vermehrung von ex vivo Lymphozyten, der Sortierung der vermehrten Lymphozyten und der Restimulierung dieser Zellen basierte, wurde im Zuge dieser Studie etabliert und diente daraufhin zur Feststellung der Antigenspezifität der stimulierten Lymphozyten sowie zur Untersuchung der Verteilung der stimulatorischen Antigene in den verschiedenen, getesteten Präparationen (Tuberkulin, CME(BCG), CME(H37Rv), LppEL). Die Verteilung der stimulatorischen Antigene wurde zusätzlich innerhalb des Genus Mycobacterium unter Verwendung von CMEs von verschiedenen MTC-Stämmen, einschließlich klinischer, (M. bovis AN5, M. tuberculosis CDC 1551, Haarlem 2336, HN 878, Beijing 1934, East African-Indian strains 1797 und 91/0079, M. canetti), und CMEs von nicht- tuberkulösen Mykobakterien (NTM) (M. marinum, M. avium ssp. avium and M. avium ssp. paratuberculosis, M. leprae, M. fortuitum) untersucht. Es wurde angestrebt, die molekulare Struktur der stimulatorischen Antigene in den Lipidpräparationen durch zwei komplementäre Ansätze zu identifizieren: Aufreinigung von Lipopeptiden aus angereicherten Präparationen mittels Umkehrphasen-Chromatographie und Untersuchung des stimulatorischen Potenzials von synthetischen, N-terminalen Peptiden von M. tuberculosis-Lipoproteinen.
Die durchflusszytometrische Auswertung des ex vivo-Lymphozytenproliferationsassays zeigte, dass Meerschweinchen starke adaptive Lymphozytenreaktionen nach Sensibilisierung mit sowohl BCG als auch inaktiviertem, virulentem M. bovis AN5 entwickeln. Die Lymphozyten proliferierten nach Stimulierung mit CME-Präparationen von M. bovis BCG und M. tuberculosis H37Rv. Die CME(BCG)-stimulierte Proliferation war ähnlich stark wie die durch Tuberkulin hervorgerufene Lymphozytenreaktion und wurde durch ca. 45 % nur noch schwach CFSE-gefärbte Lymphozyten aus BCG-sensibilisierten Meerschweinchen repräsentiert. Diese Proliferation war signifikant stärker als die Lymphozytenreaktion auf das definierte mykobakterielle Protein-Antigen AG85A (p ≤ 0.0001, Students t-Test). Jedoch stimulierten die oben aufgeführten Präparationen von BCG-Bakterien ebenfalls eine starke Proliferation (signifikant über 20 % CFSE-schwache Zellen, p ≤ 0.001, t-Test mit einer Stichprobe). Die CME(BCG)-reaktiven Lymphozyten waren vorwiegend (ca. 83 %) CD4-positive T-Zellen. Delipidierung als auch Protease-Behandlung von CME(BCG) verminderte das stimulatorische Potenzial signifikant (p ≤ 0.0001, Students t-Test) zu Medianwerten unter 20 % CFSE-schwachen Zellen. Den gleichen Effekt auf die ex vivo Lymphozytenproliferation hatte die Delipidierung als auch die Proteinase K-Behandlung von Tuberkulin. Weiterhin zeigte sich eine ähnlich starke mediane Lymphozytenproliferation wie in der Reaktion auf die ursprüngliche CME(H37Rv)-Präparation, wenn ex vivo PBMCs mit der Lipopeptid-angereicherten Subfraktion von CME(H37Rv) (LppEL) stimuliert wurden. Die beiden proliferativen Reaktionen waren positiv korreliert (r = 0.64, Spearman-Korrelation). Es konnte unter Verwendung des Restimulationsassays bestätigt werden, dass die proliferierenden T-Zellen spezifisch auf in Tuberkulin, CME(BCG), CME(H37Rv) als auch in LppEL vorhandene Antigene reagierten. Starke Proliferation (im Mittel signifikant über 20 % CFSE-schwache Zellen, p ≤ 0.05, t-Test mit einer Stichprobe) ließ sich jedoch ausschließlich als Reaktion auf CME-Präparationen von MTC-Bakterien beobachten. Im Gegensatz dazu überstieg die mittlere proliferative Reaktion auf CME-Präparationen von NTM die 20-%-Grenze nicht signifikant (p > 0.05). Bis zum jetzigen Zeitpunkt war es nicht möglich, einzelne Lipopeptide, welche die beobachtete, starke Lymphozytenproliferation ausmachten, zu identifizieren. Es ist jedoch bemerkenswert, dass einige synthetische N-terminale Peptide von M. tuberculosis-Lipoproteinen (LprG, PstS3, LppW, LprL, Pitlp und LppD) im Mittel oder in einzelnen Meerschweinchen stärkere Lymphozytenproliferation stimulierten.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Meerschweinchen für Studien über adaptive Immunantworten auf MTC-Bakterien geeignet ist und im Speziellen ein gutes Modell zur Untersuchung der BCG-Impfung unter definierten experimentellen Bedingungen darstellt. Alle Ergebnisse spiegeln die Beobachtungen in M. tuberculosis-infizierten Menschen wider. Starke Evidenz für das stimulatorische Potenzial und die Relevanz von Lipopeptiden in den CME-Präparationen wurde durch drei unabhängige, immunologische Ansätze geliefert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Lipopeptide einen Großteil des stimulatorischen Potenzials nicht nur von CME, sondern auch von Kochschem Alttuberkulin ausmachen. Die Daten unterstützen die Annahme, dass BCG starke Antigene, wie z.B. die mutmaßlichen Lipopeptide, in großen Mengen exprimiert und freisetzt. Die vermuteten Lipopeptide werden anscheinend spezifisch innerhalb des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes exprimiert oder erkannt; in nicht-tuberkulösen Mykobakterien jedoch nur selten. Die Identifizierung einzelner starker Lipopeptid-Antigene bedarf weiterer Untersuchungen. In diesem Zusammenhang ist in Betracht zu ziehen, dass zur Stimulierung von ähnlich starken Lymphozytenreaktionen, wie sie nach Inkubation mit komplexen, Lipopeptid-haltigen Antigengemischen, wie z.B. CME, beobachtet wurden, gegebenenfalls Antigengemische verschiedener, starker Lipopeptid-Einzelantigene benötigt werden, deren Existenz die hier beschriebenen Ergebnisse nahelegen.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand