Giessener Elektronische Bibliothek

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Magnetresonanztomographischer semiquantitativer Nachweis von kontrastmittelmarkierten mesenchymalen Stammzellen in chondralen Defekten am Kniegelenk des Hundes

John, Karen


Originalveröffentlichung: (2016) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-120472
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12047/

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Kleintiere, Chirurgie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6430-3
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 23.05.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Trotz vielfältiger Anwendung von Stammzelltherapien am lebenden Organismus ist der Verbleib und die biologische Aktivität der Stammzellen in vielen Fällen noch ungeklärt (Edelman et al. 2006, Tobias et al. 2012). Das Einbringen von mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte zählt zu den favorisierten Therapiekonzepten in der Regeneration von hyalinem Knorpel und ist zentraler Gegenstand vieler aktueller Forschungsvorhaben (Liu et al. 2002, Guo et al. 2004, Lopez-Laguna et al. 2011, Thiede et al. 2012).
Die in - vivo Visualisierung von implantierten Stammzellen mittels Magnetresonanztomographie stellte eine nicht invasive Methode zur Erlangung weiterer Erkenntnisse über den Verbleib und Wirkmechanismus der Zellen dar.
In dieser Arbeit wurden die aus dem Fettgewebe gewonnen Stammzellen fünf junger Hunde isoliert und in einem standardisierten Verfahren mit Eisenoxidpartikeln (Endorem®, 308 µg Fe / ml) markiert. Anhand der Berliner Blau Färbung, sowie einer Elektronenmikroskopischen Betrachtung wurde die Markierungseffizienz sowie die zellinterne Verteilung bewertet. In verschiedenen in - vitro Versuchen erfolgte die Untersuchung der potenziell negativen Einflüsse der Markierung auf die Zellvitalität, das Proliferationsverhalten sowie die Migrationsfähigkeit der Zellen. Nicht markierte Zellen derselben Stammzellspender dienten hierbei als negativ Kontrollgruppe.
Anschließend wurden die Zellen in eine Kollagenmatrix eingebracht und zusammen mit dieser in den zuvor geschaffenen standardisierten Knorpeldefekt im Kadaver-Kniegelenk implantiert. Es erfolgt die MRT Untersuchung im 1 Tesla Tomographen und Auswertung der gemessenen Signalintensitäten in der T2* FFE gewichteten Sequenz. Parallel wurden in einem weiteren Schritt labortechnisch die in - vitro Verträglichkeit und Anwendbarkeit des Zwei - Komponenten Kollagengels und seine Auswirkungen auf die Stammzellen evaluiert.
Es konnte gezeigt werden, dass die verwendete Endorem® - Konzentration von 308 µg Fe / ml Medium und das 24 h Inkubationsprotokoll zu einer ausreichenden Markierungseffizienz der kaninen Stammzellen führte. Des Weiteren wurden in - vitro für diese Konzentration keine negativen Einflüsse der Markierung auf die biologischen Eigenschaften und die evaluierten Parameter der Stammzellen nachgewiesen. Hierfür wurden die Zellen einer Phalloidin Färbung, einer TEM Untersuchung, einem MTT Test unterzogen sowie mittels Life Cell Imaging untersucht. Der MTT Test zeigt mit einer Signifikanz von p = 0,014 (p = 0,0034), dass Endorem® interindividuell keinen nachweisbar negativen Einfluss auf die Zellproliferation hat. Die Studie weist jedoch in den in vitro Untersuchungen zu Wachstum und Proliferation deutliche Kulturunterschiede in den Zellpopulationen der verschiedenen Spender auf. Im Pearson Korrelationstest ergeben sich eine hohe Korrelation (r = 0,87 MTT, r = 0,94 Life Cell Imaging) für den Zusammenhang zwischen den verwendete Stammzellpopulationen und der jeweiligen Proliferations- und Migrationskapazität.
Die verschiedenen Zellpopulationen bewiesen in beiden Tests hoch signifikanten (p = 0,0012 MTT, 0,0008 Life Cell Imaging) einen stärkeren Einfluss auf die Proliferation und Migration, im Vergleich zu den Auswirkungen der Endorem® - Markierung.
Bei der Evaluation der Verträglichkeit und Unschädlichkeit des Kollagengels zeigten sich in vitro exzellente Ergebnisse für die Zellvitalität und Migration innerhalb und außerhalb des Gels. Einzig die Verarbeitung des Gels im Bereich des Knorpeldefektes erwies sich auf Grund von Lufteinschlüssen in der späteren MRT - Untersuchung als nachteilig.
Die subjektiv vom Untersucher ausgewerteten T2* FFE gewichteten Aufnahmen bewiesen eine verlässliche Detektion der markierten Stammzellen im artifiziell geschaffenen Knorpeldefekt des Kniegelenkes (im Bereich 0,00 – 10.00 x 105 Zellen / ml). Mit steigender Zellkonzentration konnte eine invers proportionale, signifikante Abnahme der Signalintensität in der gemessenen Region of Interest (ROI) nachgewiesen werden (p = 0,016).
Das eisenoxidhaltige Kontrastmittel Endorem® stellt somit in Kombination mit einem kollagenen Trägermaterial eine optimale Basis zum Nachweis von implantierten Stammzellen in der MRT dar. Die hier gewonnen Ergebnisse ermöglichen einen zukünftigen effektiven und kontrollierten klinischen Einsatz der Stammzellen am Tier und bieten die Möglichkeit, Wirkmechanismus und Verbleib der Zellen weiter zu erforschen.
Kurzfassung auf Englisch: In many cases the disposition and biological activity of stem cells remains unexplained despite manifold applicability of stem cell therapies for living organisms (Edelman et al. 2006, Tobias et al. 2012). The placement of mesenchymal stem cells in chondral defects is amongst the most favored therapy concepts for the regeneration of hyaline cartilage and is a central subject in many ongoing research projects (Liu et al. 2002, Guo et al. 2004, Lopez-Laguna et al. 2011, Thiede et al. 2012).
The in - vivo visualization of implanted stem cells by magnetic resonance tomography represented a non-invasive methodology in order to gain further insight about the disposition and mode of action of the cells.
Stem cells, obtained from the adipose tissue of five young dogs, have been isolated for this study and labelled with iron oxide particles (Endorem®, 308 µg Fe / ml) in a standardized procedure. The efficiency of the labelling and the intracellular distribution were assessed by using Prussian blue staining as well as electron microscope observation. Various in - vitro tests examined whether any potentially negative influences of the labelling on the cell viability, the proliferation or migration capacity could have been detected. The control group consisted of unlabeled cells of the same donor animal.
As a next step the cells were inserted in a collagenmatrix and collectively implanted in the artificially created standardized chondral defect within the stifle joint of the test carcass. An MRI examination is conducted using a 1 Tesla tomograph and analyzing the resulting signal intensities for the T2* FFE sequence. The in - vitro compatibility and applicability of the two-component collagenous gel and its effects onto the stem cells were evaluated in the laboratory at the same time.
It was possible to provide evidence, that the applied concentration with Endorem® of 308 µg Fe / ml medium and the 24 h incubation procedure led to a sufficient labelling efficiency for canine stem cells. Furthermore there were no negative influences of the labelling onto biological properties and evaluated parameters of the stem cells detectable. The cells were examined by using a Phalloidin staining, a TEM investigation, an MTT test procedure as well as a culture insert during life cell imaging. The MTT test showed with significance level p = 0,014 (p = 0,0034) evidence that Endorem® had inter - individually no measurable negative effect for the proliferation of cells. The study demonstrated indeed significant differences of the various cultures of donor cell lines regarding growth and proliferation during the in - vitro investigations. Correlating according to Pearson´s test, the results are a highly significant correlation (r = 0,87 MTT, 0 = 0,94 life cell imaging) for the interdependencies between the stem cell populations and the relevant proliferation and migration capacities.
The influence of different cell populations supersedes with high significance level (p = 0,0012 MTT, 0,0008 life cell imaging) in both test methods the influence of the Endorem® labelling onto proliferation and migration.
The evaluation of compatibility and neutrality of the collagen gel was proven by excellent in vitro results for cell vitality and migration within and outside the gel. Solely the treatment of the gel within the area of the chondral defect negatively affected by embedded air blisters the following MRT imaging analysis.
By analyzing the T2* FFE imaging subjectively the examiner was able to verify a reliable detection of the labelled stem cells within the artificially created chondral defect of the knee joint (range: 0,00 – 10.00 x 105 cells / ml). The increase of the cell concentration resulted in an inversely proportional, significant reduction of signal intensity within the measured region of interest (ROI) (p = 0,016).
The Endorem® containing iron oxide in combination with a collagenous matrix is therefore an optimal basis in order to verify implanted stem cells by using MRT. The demonstrated results in this study enable an effective and controlled clinical application of stem cells for animals in the future and provide the basis to further examine mode of action and disposition of the cells.
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