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Enzyme-modified solution-gated AlGaN/GaN field-effect transistors for quantitative analysis of covalently immobilized enzymes

Müntze, Gesche Mareike


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-120388
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/12038/

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Freie Schlagwörter (Englisch): penicillinase , acetylcholinesterase , myenteric neurons , myenteric plexus , AlGaN/GaN HEMT
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: I. Physikalisches Institut
Fachgebiet: Physik
DDC-Sachgruppe: Physik
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.04.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 28.04.2016
Kurzfassung auf Englisch: In this work enzyme-modified solution-gated AlGaN/GaN field-effect transistors (EnFETs) were prepared using the enzymes penicillinase (PenFETs) and acetylcholinesterase (AcFETs). Covalent immobilization of the enzymes on the gate surface was carried out via silanization with (3-aminopropyl)triethoxysilane followed by crosslinking with glutaraldehyde. The successful silanization was proven by X-ray photoelectron spectroscopy.
Quantitative analysis of the PenFET response curves at varied measurement conditions demonstrated the applicability of the used kinetic model for pH-sensitive solution-gated EnFETs. The quantitative analysis allowed the determination of the respective Michaelis constant as well as three normalized rate constants which describe the transport of protons, buffer molecules and substrate molecules through the EnFET/enzyme/electrolyte interface.
By evaluation of those four model parameters the influence of buffer concentration and pH-value on the PenFET response curves could be assessed. Furthermore, the extracted model parameters made an investigation of the stability of PenFETs and AcFETs possible. Here, PenFETs could be analyzed with the kinetic model over the course of 252 days while analysis of AcFETs was only feasible over the course of 77 days. In addition, analysis with the kinetic model allowed the quantitative comparison of the response curves of PenFETs and AcFETs, as well as the conclusion that the method used for the enzyme immobilization is highly reproducible.
Based on those results, AcFETs were successfully used for the detection of the neurotransmitter acetylcholine which was released by stimulated neuronal tissue cultivated on the gate surface. In the context of this work three types of neuronal tissue were investigated: isolated myenteric neurons from (4 - 12) days old Wistar rats as well as myenteric neurons still embedded in the muscularis propria and coeliac ganglia from adult Wistar rats. In all casees, the response of an AcFET towards the release of acetylcholine could be linked to the activity of the covalently immobilized acetylcholinesterase by utilizing the reversible acetylcholinesterase blocker donepezil. These results demonstrate the realization of a functional neuron/AcFET hybrid.
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurden Enzym-funktionalisierte AlGaN/GaN Feldeffekttransistoren (EnFETs) mit einem elektrolytischen Gate unter Verwendung der Enzyme Penicillinase (PenFETs) und Acetylcholinesterase (AcFETs) hergestellt. Die kovalente Anbindung der Enzyme an die Gateoberfläche erfolgte dabei durch Silanisierung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan, gefolgt von der Verwendung des Crosslinkers Glutaraldehyd. Die Charakterisierung mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie zeigte die erfolgreiche kovalente Anbindung der Funktionalisierungsschicht.
Durch quantitative Analyse der PenFET Antwortkurven bei unterschiedlichen Messbedingungen konnte nachgewiesen werden, dass das verwendete kinetische Model für zur Modellierung von pH-sensitiven EnFETs mit einem elektrolytischen Gate ausgezeichnet geeignet ist. Anhand dieser Analyse war es möglich die Michaelis-Menten-Konstanten der Enzyme und drei normalisierte Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen, die den Transport von Protonen, Puffermolekülen und Substratmolekülen durch die EnFET/Enzym/Elektrolyt-Grenzfläche quantitativ beschreiben.
Mit Hilfe dieser vier Parameter wurde der Einfluss des pH-Wertes und der Pufferkonzentration auf die Antwortkurven von PenFETs sowie die Langzeitstabilität der AcFETs und PenFETs untersucht. Hierbei zeigte sich, dass PenFETs über einen Zeitraum von 252 Tagen auswertbare Antwortkurven lieferten, wohingegen AcFETs nur über einen Zeitraum von 77 Tagen messbar waren. Des Weiteren erlaubte die Analyse mit dem kinetischen Modell einen direkten quantitativen Vergleich der Antwortkurven der beiden EnFETs und ließ die Schlussfolgerung zu, dass die zur Enzym-Funktionalisierung verwendete Methode in hohem Maße reproduzierbar ist.
Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnten AcFETs erfolgreich dazu benutzt werden, die Ausschüttung des Neurotransmitters Acetylcholin durch stimuliertes neuronales Gewebe, das auf der Gateoberfläche der AcFETs kultiviert wurde, zu erfassen. Für diese Arbeit wurden isolierte myenterische Neuronen von acht bis zwölf Tage alten Wistar-Ratten, sowie Ganglia coeliacum und noch im Gewebe eingebettete myenterische Neuronen von ausgewachsenen Wistar-Ratten untersucht. In allen drei Fällen konnte durch die Verwendung des reversiblen Acetylcholinesteraseblockers Donepezil die Reaktion des AcFETs auf die Ausschüttung von Acetylcholin mit der Aktivität der kovalent auf der Gateoberfläche angebundenen Acetylcholinesterasen eindeutig in Verbindung gebracht werden. Die Realisierbarkeit einer funktionalen Neuron/AcFET-Hybridstruktur konnte somit gezeigt werden.
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