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Biotransformationen von Lignosulfonaten und Herbiziden durch Basidiomyceten

Biotransformations of lignosulfonates and herbicides by basidiomycetes

Imami, Adrian


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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-119528
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2016/11952/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Biotransformationen , Lignosulfonate , Herbizide , Basidiomyceten
Freie Schlagwörter (Englisch): biotransformations , lignosulfonates , herbicides , basidiomycetes
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Lebensmittelchemie und -biotechnologie
Fachgebiet: Biologie, Chemie und Geowissenschaften fachübergreifend
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.02.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 25.02.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Auf Grundlage von Vorarbeiten am LCB konnte gezeigt werden, dass der Basidiomycet Irpex consors in der Lage ist, das durchschnittliche Molekulargewicht von Lignosulfonaten aus Sulfitablaugen deutlich zu reduzieren. Weiterführende Untersuchungen wurden zum Einfluss der Konzentration der Lignosulfonate auf die Depolymerisierung durchgeführt. Ferner gelang es, eine Korrelation zwischen der Depolymerisierung der Lignosulfonate und den sekretierten ligninolytiyschen Enzymen aus I. consors aufzuzeigen. Die Reinigung einer versatilen Peroxidase aus Kulturüberständen von I. consors verlief erfolgreich. Peptidfragmente des gereinigten Enzyms konnten mittels Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Tandem-Massenspektrometrie (LC MS/MS) sequenziert und anhand von Datenbankabgleich identifiziert werden. Die isolierte versatile Peroxidase aus I. consors wurde kloniert und die codierende cDNA-Sequenz charakterisiert.
Zur Steigerung der Anzahl der phenolischen Hydroxy-Gruppen von Lignosulfonaten wurde ein Screening mit 20 Basidiomyceten durchgeführt. Mit den im Screening identifizierten Braunfäulepilzen Antrodia serialis und Gloeophyllum trabeum gelang eine deutliche Erhöhung der Konzentration an phenolischen Hydroxy-Gruppen der Lignosulfonate. Die Steigerung konnte mit Hilfe der Extinktionszunahme in den UV-Differenzspektren eindeutig nachgewiesen werden. Weitere Versuche zeigten, dass G. trabeum bei höheren Konzentrationen an Lignosulfonaten ähnliche Modifikationen bewirkte. Schließlich konnte die Erhöhung der Anzahl phenolischer Hydroxy-Gruppen der Lignosulfonate durch G. trabeum im größeren Maßstab in einem Rührreaktor (15 L) reproduziert werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden 29 Basidiomyceten zur Erzeugung von Bodenmetaboliten des Herbizids Dimethenamid-P (DMTA-P) in Oberflächen- und Flüssigkulturen gescreent. Der Basidiomycet I. consors war in der Lage, 70% des eingesetzten DMTA-P (0,5 g/L) in Flüssigkulturen in einem synthetischen Minimalmedium innerhalb von 6 Tagen umzusetzen. Bei der Umsetzung des DMTA-P konnten 9 Transformationsprodukte mittels LC–MS identifiziert werden. Ferner wurden die vier Hauptmetabolite aus dem Kulturüberstand isoliert und deren Struktur mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie und Kernspinresonanz-Spektroskopie eindeutig aufgeklärt werden. Der Metabolit M1 wurde als S-Oxid des DMTA-P identifiziert, bei Metabolit M2 war ein Methyl-Substituent des DMTA-P monohydroxyliert. Die beiden Metaboliten M3A und M3B waren chemisch identisch, obwohl sie chromatographisch vollständig getrennt werden konnten. Es handelte sich bei den Metaboliten um Thiolactone, die vermutlich aus ein initialen Hydroxylierung des Thiophenrings hervorgingen.
Zudem wurde ein Screening zur Umsetzung des DMTA-P-Derivates M27 mit einem weiten Spektrum an Basidiomyceten durchgeführt. Durch gleichzeitige Supplementierung des Kulturmediums mit M27 und Weizenstroh wurde ein vollständiger Abbau des Herbizid-Derivates durch I. consors und G. trabeum erzielt. Nach Inklusion des Strohs und des Myzels von I. consors in einer Natrium-Alginat Matrix wurde der chlorierte Metabolit M27Cl mittels LC–MS und NMR-Spektroskopie eindeutig identifiziert.
Kurzfassung auf Englisch: Based on previous studies, the basidiomycete Irpex consors was shown to reduce the average molecular weight of lignosulfonates from spent sulfite liquors significantly in submerged cultures. Further studies were carried out to examine the influence of the concentration of the lignosulfonates on the depolymerization. A strong correlation between the depolymerization of the lignosulfonates and the responsible secreted ligninolytic enzymes of I. consors has been shown. A versatile peroxidase was purified from the culture supernatants of I. consors. The purified enzyme was subjected to LC-MS/MS analyses, and the obtained peptide fragments were compared to databases. By means of these data, the cDNA encoding the isolated versatile peroxidase was cloned in various steps and characterized.
A second screening including 20 basidiomycetes was carried out to increase the number of phenolic OH-groups of the lignosulfonates. The basidiomycetes Antrodia serialis and Gloeophyllum trabeum significantly raised the content of phenolic OH-groups of the lignosulfonates as indicated by UV-difference-spectroscopy. The increase of the phenolic OH-groups of the lignosulfonates by G. trabeum was reproduced in an upscaling experiment using a stirred-tank bioreactor (15 L).
In the second part of this work, twenty-nine basidiomycetes were screened in surface and liquid cultures for their capability to biotransform the chloroacetamide herbicide Dimethenamid-P (DMTA-P). The basidiomycete I. consors converted 70% of the herbicide (0.5 g/L DMTA-P) in liquid cultures within 6 days, applying a synthetic minimal medium. Nine transformation products of DMTA-P were identified by liquid chromatography–mass spectrometry (MS) analysis of the culture supernatants. The four main metabolites were isolated and subjected to gas chromatography–MS analysis and nuclear magnetic resonance–spectroscopy. The analyses revealed that the thiophene ring was oxidized at three different positions. Metabolite M1 was identified as the S-oxide which was isolated and comparatively stable at room temperature. In metabolite M2, the methyl substituent of the thiophene ring was monohydroxylated. The two metabolites M3A and M3B were chemically identical, although being fully separated by HPLC. Here, oxidation of the aromatic proton resulted in tautomerization and formation of the corresponding thiolactone.
Moreover, a screening with a broad spectrum of basidiomycetes was conducted for the biotransformation of the DMTA-P derivative M27. By simultaneous supplementation of the minimal medium with M27 and wheat straw, the herbicide derivative was fully degraded by the basidiomycetes I. consor and G. trabeum. An encapsulation of the wheat straw and the mycelia of I. consors in a sodium alginate matrix resulted in a chlorinated metabolite M27Cl which was characterized by LC–MS/MS analyses and NMR-spectroscopy.
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