Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Etablierung und Evaluierung eines Capture-ELISAs zum Nachweis des Beta2-Toxins von Clostridium perfringens aus Feldisolaten

Sommer, Alexa


Originalveröffentlichung: (2015) Giessen : VVB Laufersweiler Verlag
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.641 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-117126
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11712/

Bookmark bei del.icio.us


Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Institut f√ľr Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6356-6
Sprache: Deutsch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 26.05.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 14.10.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Beta2-Toxingen-positive C. perfringens Typ A- und C-St√§mme werden h√§ufig bei Durchfallerkrankungen von Saugferkeln isoliert. Die Bedeutung des Beta2-Toxins in der Pathogenese ist bisher nicht eindeutig gekl√§rt. Der Nachweis Beta2-Toxingen-positiver St√§mme, die mittels PCR identifiziert werden, l√§√üt keinerlei Aussage dar√ľber zu, ob und wie viel Beta2-Toxin w√§hrend der Vermehrung in den Kultur√ľberstand exprimiert wird. Es wurde daher versucht, eine quantitative Methode zu entwickeln, die eine Bestimmung des Beta2-Toxingehalts in C. perfringens-Kultur√ľberst√§nden erlaubt.
Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit ein Fangantik√∂rper-ELISA zum Nachweis von Beta2-Toxin aus C. perfringens-Kultur√ľberst√§nden entwickelt. Der Test wurde auf seine Eignung f√ľr den quantitativen Nachweis von Beta2-Toxin in C. perfringens-Kultur√ľberst√§nden, die von Isolaten aus Kotproben gesunder und durchfallerkrankter Ferkel gewonnen wurden, gepr√ľft.
Mittels pASK-IBA2 Vektor gelang die gezielte Expression eines rekombinanten Beta2-Toxins aus E. coli. Unter Verwendung des affinitätchromatographisch aufgereinigten rBeta2-Toxins konnten nach Immunisierung, Wildtyptoxin-erkennende polyklonale (pAk) und zwei monoklonale Antikörper (2-4A5 und 2-4C11) gewonnen werden.
Unter Verwendung von C. perfringens-Kultur√ľberst√§nden sowie Kultur√ľberst√§nden weiterer grampositiver und gramnegativer Keime wurde der entwickelte Fangantik√∂rper-ELISA auf Reproduzierbarkeit, Verd√ľnnungsechtheit, Sensitivit√§t und Spezifit√§t getestet.
Mittels Inter-Assay-Präzision wurde die Reproduzierbarkeit bzw. der Grad der Schwankungen des ELSIA zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei wiederholter Testung gemessen, wobei der Variationskoeffizient <20% betrug, was einer hinreichenden Genauigkeit entspricht.
Mittels Intra-Assay-Pr√§zision wurden die Schwankungen innerhalb eines Ansatzes √ľberpr√ľft und die gute Reproduzierbarkeit des Systems, mit einem Variationskoeffizienten <20%, best√§tigt.
Die Sensitivität des Beta2-spezifischen Fangantikörper-ELISAs lag nach Untersuchungen mit 18 genotypisch Beta2-positiven C. perfringens-Feldisolaten bei 100 %.
Kultur√ľberst√§nde anderer Clostridienspezies sowie grampositiver und gramnegativer Keime zeigten keinerlei Kreuzreaktion mit den im Fangantik√∂rper-ELISA verwendeten Nachweisantik√∂rpern. Daraus ergab sich eine Diagnostik-Spezifit√§t von 100%.
48 C. perfringens-Feldisolate, die von Kotproben gesunder und kranker Ferkel stammten, wurden mittels des Beta2-spezifischen Fangantik√∂rper-ELISAs untersucht. Der gemessene Beta2-Toxin Gehalt in den Kultur√ľberst√§nden von Isolaten aus Kotproben erkrankter Tiere, zeigte bei beiden mAk (2-4A5 und 2-4C11) f√ľnffach h√∂here Werte als die bei den Isolaten gesunder Saugferkel. Im genotypischen Nachweis handelte es sich um 88 % Typ A-St√§mme und 12 % Typ C-St√§mme.
Dar√ľber hinaus wurde untersucht, ob bei nativem und rekombinantem Beta2-Toxin eine zytotoxische Wirkung nachgewiesen werden kann. An verschiedenen Zelllinien lie√ü sich sowohl f√ľr das native als auch das rekombinante Toxin eine Zytotoxit√§t nachweisen, wobei das native Beta2-Toxin eine bis zu achtfach h√∂here Zytotoxizit√§t gegen√ľber dem rekombinant hergestellten Beta2-Toxin aufwies. In weiteren Versuchen an Kaninchen- und Ferkelerythrozyten zur H√§molyse-Wirkung von Alphatoxin war festzustellen, dass die Alphatoxin-induzierte H√§molyse durch Zugabe von rBeta2-Toxin signifikant gesteigert werden konnte, was deutliche Hinweise auf einen Synergismus beider Toxine gibt. Dies wird best√§tigt durch die Tatsache, dass sich dieser Effekt durch Zugabe des Beta2-spezifischen mAk 2-4C11 zum Pr√§inkubationsgemisch (rBeta2 und PLC) aufheben lie√ü.
Der hier entwickelte Fangantik√∂rper-ELISA stellt eine geeignete Methode zum quantitativen Nachweis von Beta2-Toxin in C. perfringens-Kultur√ľberst√§nden unter Routinebedingungen dar.
Kurzfassung auf Englisch: C. perfringens Type A and C strains which produce Beta2-toxins, are often isolated during diarrhoea. The exact meaning of these Beta2-toxins are yet unknown. No assumption can be made, by PCR determined Beta2-toxin positive C. perfringens species, if and how much Beta2-toxin is expressed in the culture supernatant. Hence, the aim of this study was to establish a quantitative method, a Capture-ELISA, which determines the Beta2-toxin concentration in culture supernatant of C. perfringens. Its suitability was tested with C. perfringens isolates derived from faecal samples of healthy and diarrhoea sick piglets.
A focused expression of the recombined Beta2-toxin from E. coli was achieved, using a pASK -IBA2 vector. The use of purified recombined Beta2-toxin, through affinity chromatography, enabled the gain of wildtype toxin recognising polyclonal (pAB) and monoclonal antibodies (mAB, 2-4A5 and 2-4C11), after immunisation.
Culture supernatant of C. perfringens, and also the culture supernatant of other Gram positive and Gram negative bacteria were used to test and determine the reproducibility, dilution authenticity, sensitivity and specificity of the established Capture-ELISA.
Inter/Intra-Assay-Precision Tests examined the reproducibility and respectively, the fluctuation of the Capture-ELISA at different time intervals, as well as within each trial attempt. In both cases, a coefficient of variation < 20% resulted, indicating a sufficient accuracy.
The sensitivity of the Beta2-specific Capture-ELISA was 100%, after the analyses of 18 genotypical Beta2-positive C. perfringens field isolates.
Culture supernatants of other Clostridia species, Gram negative and Gram positive bacteria showed no cross reaction with the Capture-ELISA used antibodies. Therefore, a diagnostic specificity of 100% is given.
48 C. perfringens field isolates, which were obtained from faecal samples of healthy and sick piglets, were analysed with the Beta2-specific Capture-ELISA. Faecal samples of the sick piglets showed fivefold higher concentrations of Beta2-toxin for both mABs (2-4A5 and 2-4C11) compared to fecal samples of the healthy piglets. C. perfringens Type A strains represented 88% and C. perfringens Type C strains represented 12% within the faecal samples.
Possible cytotoxic effects of native and recombined Beta2-toxin were also examined. Both native and recombined Beta2-toxin showed cytotoxic effects in different cell lines, although the cytotoxic effect of native Beta2-toxin was eightfold higher than that of the recombined Beta2-toxin. The addition of the recombined Beta2-toxin provoked a significant increase of α toxin- induced haemolysis, indicating a synergistic effect for both toxins. This effect is abolishable when adding Beta2-specific mAB 2-4C11 in the preincubation mixture of the recombined Beta2-toxin with PLC.
The established Capture-ELISA is a useful method for the quantitative determination of Beta2-toxin in C. perfringens culture supernatants under routine conditions.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand