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Generation of pure endothelial cells from transgenic embryonic stem cells exhibiting an endothelial cell-specific expression of green fluorescent protein upon differentiation

Raissi Dehkordi, Maria


Originalveröffentlichung: (2015) Giessen : Laufersweiler
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.971 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-114717
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2015/11471/

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Universität Justus-Liebig-Universit├Ąt Gie├čen
Institut: Medical Clinic and Polyclinic II; Max Planck Institute for Heart and Lung Research, W.G. Kerckhoff Institute, Bad Nauheim
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 978-3-8359-6316-0
Sprache: Englisch
Tag der m├╝ndlichen Pr├╝fung: 11.12.2014
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 27.05.2015
Kurzfassung auf Englisch: Embryonic stem (ES) cell-derived endothelial cells (EC)s may be used as a therapeutic option in experimental models of diseases originating from vascular lesions. Moreover, studies on these cells may provide insight into EC development and differentiation in the human body. In this regard, it is fundamentally required to label, track, and finally isolate a pure population of ES-cell-derived ECs. In this study, a murine ES cell line was established, which expressed green fluorescent protein (GFP) as well as a zeocin resistance gene under the control of the murine Vascular Endothelial (VE)-cadherin promoter after lentiviral transduction of single ES cells. 192 ES colonies derived from single transduced ES cells were picked randomly and directed to differentiation. From day 6 of differentiation, 12.5% of the clones showed GFP-positive vessel-like structures. Immunofluorescence microscopy demonstrated the co-expression of various EC markers (VE-cadherin, CD31) on ES cell-derived vascular structures. Based on flow cytometry, the highest GFP expression level could be observed in embryoid bodies at differentiation day 8. Flow-cytometric cell sorting at this time point revealed a significantly higher level of expression of the majority of investigated EC markers in the GFP-positive compared to the GFP-negative population. In addition, magnetic beads were used for the isolation of ECs based on CD31 expression. The sorted cells were subsequently subjected to gene profiling, in order to determine the optimal time point for the isolation and subsequent culture of ECs. In the sorted cells on days 6 and 8 of differentiation, all investigated markers of EC differentiation and transcription factors of vasculogenesis demonstrated a markedly higher expression in the CD31-positive versus CD31-negative population. Cultured CD31-positive cells at differentiation day 6 developed a characteristic EC cobblestone morphology, co-expressed GFP and different endothelial markers, and eventually formed tube-like structures. In conclusion, generation of ES cell clones expressing GFP upon differentiation to ECs, and their sorting based on CD31, provides a feasible method for the production of pure labeled ECs. This system may serve as a powerful tool for studies on the differentiation of ECs from ES cells and induced pluripotent stem cells, as well as prospective cellular therapeutic approaches in various diseases associated with vascular damage.
Kurzfassung auf Deutsch: Aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) abgeleitete Endothelzellen k├Ânnen in Modellen zur Therapie von Erkrankungen, die mit vaskul├Ąren L├Ąsionen assoziiert sind, eingesetzt werden. Au├čerdem geben ES Zellstudien wichtige Einblicke in die Entwicklung und Differenzierung von Endothelzellen im menschlichen Organismus. F├╝r diese Zwecke ist es essentiell, die aus ES-Zellen abgeleiteten Endothelzellen zu markieren und nachzuverfolgen und die differenzierten Zellen schlie├člich in eine reine Zellpopulation zu ├╝berf├╝hren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine murine ES-Zell-Linie generiert, welche nach lentivirusbasierter Transduktion von ES Zellen das gr├╝n fluoreszierende Protein (GFP) sowie ein Zeocin-Resistenzgen unter Kontrolle des murinen vaskul├Ąren endothelialen (VE)-Cadherin-Promotors exprimiert. 192 aus einzel-transduzierten ES-Zellen abstammende ES-Zellkolonien wurden zuf├Ąllig selektiert. Ab Tag 6 der Differenzierung zeigten 12,5% der Klone GFP-positive vaskul├Ąre Strukturen mit Co-Expression verschiedener vaskul├Ąrer Marker (VE-Cadherin, CD31). Die durch Durchflusszytometrie am Tag 8 der Differenzierung selektierten GFP-positiven Zellen zeigten eine signifikant h├Âhere Genexpression verschiedener Endothelzellmarker als die GFP-negative Zellpopulation. Dar├╝ber hinaus wurde ein weiteres, auf der Expression von CD31 basierendes Verfahren zur Selektion der aus ES Zellen abgeleiteten Endothelzellen angewendet und das Genprofil der selektierten Endothelzellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung analysiert. Auf diese Weise wurde der optimale Zeitpunkt f├╝r die Isolierung und anschlie├čende Kultivierung und Charakterisierung dieser Zellen festgelegt. Alle untersuchten Marker sowie Transkriptionsfaktoren der Endotheldifferenzierung zeigten eine deutlich h├Âhere Expression in der CD31-positiven gegen├╝ber der -negativen Zellpopulation am Tag 6 und 8 der Differenzierung. Die Kultivierung der CD31- positiven Zellen am Tag 6 der Differenzierung f├╝hrte zu einer f├╝r Endothelzellen charakteristischen Kopfsteinpflastermorphologie mit Co-Expression des GFPs mit verschiedenen endothelialen Markern. Schlie├člich bildeten die kultivierte Zellen tubul├Ąre Strukturen aus. Zusammenfassend stellt die Generierung embryonaler Stammzellklone, welche w├Ąhrend der Differenzierung zu Endothelzellen GFP exprimieren, und die Selektion dieser Zellen auf Basis der Expression von CD31, eine effiziente Methode f├╝r die Entwicklung reiner Endothelzellen dar. Diese Studien repr├Ąsentieren dar├╝ber hinaus die Voraussetzung f├╝r zuk├╝nftige detaillierte Studien zur Differenzierung von Endothelzellen aus ES Zellen und induzierten pluripotenten Stammzellen, und f├╝r die Anwendung Zell-basierter experimenteller therapeutischer Strategien bei verschiedenen vaskul├Ąren Erkrankungen.
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