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Investigations on the effects of peroxisome proliferator-activated receptors and of nuclear factor kappa B on novel organic cation transporter 2 and carnitine uptake in bovine kidney cells

Untersuchungen √ľber die Auswirkungen von Peroxisome proliferator-activated Receptors (PPAR) und des nukle√§ren Transkriptionsfaktors kappa-B (NF-kappaB) auf den organischen Kationentransporter OCTN2 und die Carnitinaufnahme in Nierenzellen von Rindern

Zhou, Xiaodan


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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-110143
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2014/11014/


Freie Schlagwörter (Deutsch): Peroxisomen proliferator-activated Receptors , PPAR , nukle√§rer Transkriptionsfaktors kappa-B , organischer Kationentransporter OCTN2 , Carnitin
Freie Schlagwörter (Englisch): peroxisome proliferator-activated receptors , nuclear factor kappa B , novel organic cation transporter 2 , carnitine
Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Institute of Animal Nutrition and Nutritional Physiology
Fachgebiet: Agrarwissenschaften, √Ėkotrophologie und Umweltmanagement fach√ľbergreifend
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 23.07.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 05.08.2014
Kurzfassung auf Englisch: L-Carnitine is a water soluble metabolite, serving as an essential cofactor for fatty acid beta-oxidation by transferring long-chain fatty acids as acylcarnitine esters across the inner mitochondrial membrane. In the body, carnitine is derived from endogenous synthesis and from the intestinal absorption from the dietary sources. Tissues which cannot provide carnitine via endogenous synthesis, like skeletal muscle or myocardium, are dependent on carnitine uptake from the circulation. Carnitine transport is mediated by OCTN2, which is sodium-dependent and has a high-affinity to carnitine. OCTN2-mediated carnitine transport is also responsible for the tubular reabsorption of carnitine in the kidney and is therefore fundamental to maintaining normal carnitine levels in serum. Recent studies in rodents convincingly demonstrated that PPARalpha, which is a well-known central regulator of lipid metabolism and energy homeostasis, is an important transcriptional regulator of genes encoding OCTN2. Gene transcription by PPARalpha is initiated when a ligand, like fatty acids which are liberated from adipose tissue during energy deprivation and taken up into tissues during this state, or exogenous ligands such as fibrates (WY-14,643) bind to the LBD of this transcription factor. In contrast to rodents, little is known with regard to the regulation of OCTN2 by PPARalpha and its isoforms PPARbeta/delta and their roles for carnitine transport in cattle. PPARbeta/delta and PPARalpha have partially overlapping functions. For instance, they are central regulators of fatty acid catabolism since both subtypes control the expression of genes encoding proteins involved in cellular fatty acid uptake, intracellular fatty acid transport, mitochondrial fatty acid uptake, and mitochondrial and peroxisomal fatty acid oxidation. Although PPARs and NF-kappaB have a negative cross talk, in cattle both PPARs and NF-kappaB are activated during transition period. It has been confirmed that OCTN2 expression and carnitine uptake in human colonic epithelial cells are increased by NF-kappaB inducer TNFalpha. However, it is unclear whether NF-kappaB is able to alter OCTN2 and carnitine uptake in bovine kidney cells. Study 1 aimed to investigate the hypothesis that PPARalpha, as in rodents, regulates OCTN2 involving in carnitine uptake in cattle. MDBK cells were incubated 24 h with 150 myM of PPARalpha agonist WY-14,643 in the absence and presence of 10 myM of PPARalpha antagonist GW6471. WY-14,643 increased mRNA and protein levels of OCTN2, whereas co-treatment of MDBK cells with WY-14,643 and GW6471 blocked the WY-14,643-induced increase of mRNA and protein levels of OCTN2. The treatment of MDBK cells with WY-14,643 stimulated specifically Na+-dependent carnitine uptake in MDBK cells, which is likely the consequence of the increased carnitine transport capacity of cells due to the elevated expression of OCTN2. In addition, WY-14,643-stimulated increase of carnitine uptake was completely blocked by treatment of cells with GW6471.
Study 2 aimed to investigate the hypothesis that PPARbeta/delta, like PPARalpha, also regulates bovine OCTN2 involving in carnitine uptake. MDBK cells were incubated for 24 h with 1 myM of PPARbeta/delta agonist GW0742 in the absence and presence of 10 myM of PPARbeta/delta antagonist GSK3787. GW0742 increased mRNA and protein levels of OCTN2, whereas co-treatment of MDBK cells with GW0742 and GSK3787 blocked the GW0742-induced increase of mRNA and protein levels of OCTN2. The treatment of MDBK cells with GW0742 stimulated specifically Na+-dependent carnitine uptake in MDBK cells. In addition, GW0742-stimulated increase of carnitine uptake was completely blocked by treatment of cells with GSK3787.
Study 3 aimed to investigate the hypothesis that NF-kappaB has a similar function as PPARs in regulating bovine OCTN2 and carnitine uptake. Dose-dependent test was performed to find the optimized concentration of TNFalpha. 5ng/ml of TNFalpha increased the transcription level of IL-6 and IL-1B, which are the well-known NF-kappaB target genes. 5 ng/ml of TNFalpha stimulated NF-kappaB transactivation in MDBK cells. MDBK cells were incubated 24 h with 5 ng/ml NF-kappaB activator TNFalpha in the absence and presence of 1 myM of NF-kappaB inhibitor BAY 11-7085. TNFalpha increased mRNA and protein levels of OCTN2, whereas co-treatment of MDBK cells with TNFalpha and BAY 11-7085 blocked the TNFalpha-induced increase of mRNA and protein levels of OCTN2. The treatment of MDBK cells with TNFalpha stimulated carnitine uptake in MDBK cells. In addition, TNFalpha-stimulated increase of carnitine uptake was completely blocked by treatment of cells with BAY 11-7085.
Kurzfassung auf Deutsch: L-Carnitin ist ein wasserl√∂slicher Metabolit, der als essenzieller Kofaktor bei der beta-Oxidation von Fetts√§uren dient, indem er langkettige Fetts√§uren als Acylcarnitinester durch die innere mitochondriale Membran transferiert. Im K√∂rper stammt Carnitin aus der endogenen Synthese und der intestinalen Resorption aus Nahrungsquellen. Gewebe, welche Carnitin nicht aus der endogenen Synthese gewinnen k√∂nnen, wie Skelett- und Herzmuskel, sind von der Aufnahme und Stoffverteilung im K√∂rper abh√§ngig. Der Carnitin-Transport wird durch den novel organic cation transporter (OCTN2) vermittelt, welcher natriumabh√§ngig ist und eine hohe Affinit√§t zu Carnitin aufweist. Der OCTN2-vermittelte Carnitintransport ist ebenso f√ľr die tubul√§re Reabsorption von Carnitin in den Nieren verantwortlich und daher √ľberaus bedeutsam, normale Carnitin-Spiegel im Serum aufrechtzuerhalten. K√ľrzlich durchgef√ľhrte Studien an Nagetieren haben √ľberzeugend demonstriert, dass peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha), ein wesentlicher Regulator im Fettstoffwechsel und der Energiehom√∂ostase, ein wichtiger transkriptionaler Regulator des OCTN2-Gens ist. Die Transkription wird durch PPARalpha initiiert, wenn Liganden, wie Fetts√§uren, die w√§hrend Energiemangel aus dem Fettgewebe freigesetzt und von anderen Geweben w√§hrend dieses Zustands aufgenommen werden, oder exogene Liganden, wie Fibrate (WY-14,643), an die Ligandenbindungsdom√§ne dieses Transkriptionsfaktors binden. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen bei Nagetieren, ist wenig bez√ľglich der Regulation von OCTN2 durch PPARalpha und seinen Isoformen PPARbeta/delta und ihrer Rollen beim Carnitintransport von Rindern bekannt. PPARbeta/delta und PPARalpha haben zum Teil √ľberlappende Funktionen. Sie sind beispielsweise wesentliche Regulatoren im Fetts√§urekatabolismus, da beide Subtypen die Expression von Genen kontrollieren, die Proteine kodieren, welche an der zellul√§ren Aufnahme von Fetts√§uren, dem intrazellul√§ren Transport von Fetts√§uren, der mitochondrialen Aufnahme von Fetts√§uren und der mitochondrialen und peroxisomalen Fetts√§ureoxidation beteiligt sind. Obwohl die PPAR-Subtypen und nuclear factor kappa B (NF-kappaB), ein Schl√ľsselregulator der Entz√ľndung, einen ‚Äěnegativen Crosstalk‚Äú aufweisen, werden w√§hrend der √úbergangszeit bei Rindern sowohl die PPAR-Subtypen, als auch NF-kappaB aktiviert. Es wurde nachgewiesen, dass die OCTN2-Expression und die Carnitin-Aufnahme in humanen Epithelzellen des Dickdarms durch den NF-kappaB-Induzierer tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) gesteigert werden. Jedoch ist unklar, ob NF-kappaB in der Lage ist, die OCTN2- und Carnitinaufnahme in Nierenzellen von Rindern zu ver√§ndern. Ziel der ersten Untersuchung war es, die Hypothese zu √ľberpr√ľfen, dass PPARalpha, wie bei Nagetieren, OCTN2 reguliert, welcher bei der Carnitinaufnahme bei Rindern beteiligt ist. Madin-Darby bovine kidney (MDBK)-Zellen wurden f√ľr 24 Stunden mit 150 myM des PPARalpha-Agonisten WY-14,643 in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 myM des PPARalpha-Antagonisten GW6471 inkubiert. WY-14,643 erh√∂hte die mRNA und Proteinspiegel von OCTN2, wohingegen die Behandlung der MDBK-Zellen mit WY-14,643 und GW6471 die WY-14,643-induzierte Erh√∂hung von mRNA- und Proteinspiegeln des OCTN2 hemmte. Die Behandlung von MDBK-Zellen mit WY-14,643 stimulierte spezifisch die Na+-abh√§ngige Aufnahme der Zellen von Carnitin, was vermutlich die Folge der erh√∂hten Carnitintransportkapazit√§t der Zellen auf Grund der gesteigerten Expression von OCTN2 ist. Dar√ľber hinaus wurde die WY-14,643-stimulierte Erh√∂hung der Carnitinaufnahme durch die Behandlung der Zellen mit GW6471 vollst√§ndig gehemmt. Ziel der zweiten Untersuchung war es, die Hypothese zu √ľberpr√ľfen, dass PPARbeta/delta, wie PPARalpha, den bovinen OCTN2 reguliert. MDBK-Zellen wurden f√ľr 24 Stunden mit 1 myM des PPARbeta/delta-Agonisten GW0742 in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 myM des PPARbeta/delta-Antagonisten GSK3787 inkubiert. GW0742 erh√∂hte die mRNAund Proteinspiegel des OCTN2, wohingegen die Behandlung der MDBK-Zellen mit GW0742 und GSK3787 die GW0742-induzierte Erh√∂hung der mRNA- und Proteinspiegel von OCTN2 hemmte. Die Behandlung von MDBK-Zellen mit GW0742 stimulierte spezifisch die Na+-abh√§ngige Aufnahme der Zellen von Carnitin. Dar√ľber hinaus wurde die GW0742-stimulierte Erh√∂hung der Carnitinaufnahme durch die Behandlung der Zellen mit GSK3787 vollst√§ndig gehemmt. Ziel der dritten Untersuchung war es, die Hypothese zu √ľberpr√ľfen, dass NF-kappaB eine √§hnliche Funktion wie die PPARs bei der Regulation der bovinen OCTN2- und Carnitinaufnahme haben. Es wurden dosisabh√§ngige Tests durchgef√ľhrt, um eine optimierte Konzentration von TNFalpha herauszufinden. 5 ng/ml TNFalpha erh√∂hten den Transkriptspiegel von interleukin (IL)-6 und IL-1B, welche Zielgene von NF-kappaB sind. 5 ng/ml TNFalpha stimulierten die Transaktivierung von NF-kappaB in MDBK-Zellen. MDBK-Zellen wurden f√ľr 24 Stunden mit 5 ng/ml NF-kappaB-Aktivator TNFalpha in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 myM des NF-kappaB-Inhibitors BAY 11-7085 inkubiert. TNFalpha erh√∂hte die mRNA- und Proteinspiegel des OCTN2, wohingegen die Behandlung der MDBK-Zellen mit TNFalpha und BAY 11-7085 die TNFalpha-induzierte Erh√∂hung der mRNA- und Proteinspiegel von OCTN2 hemmte. Die Behandlung von MDBK-Zellen mit TNFalpha stimulierte die Carnitinaufnahme der Zellen. Dar√ľber hinaus wurde die TNFalpha-stimulierte Erh√∂hung der Carnitinaufnahme durch die Behandlung der Zellen mit BAY 11-7085 vollst√§ndig gehemmt. Zusammenfassend ist die Erkenntnis aus dieser Dissertation, dass PPARalpha, PPARbeta/delta und NF-kappaB die OCTN2- und OCTN2-vermittelte Carnitinaufnahme in Nierenzellen von Rindern regulieren. Dies d√ľrfte eine Erkl√§rung f√ľr die k√ľrzliche Beobachtung liefern, derzufolge der mRNA-Spiegel von OCTN2 und die Carnitin-Konzentration in der Leber von Hochleistungsmilchk√ľhen w√§hrend der fr√ľhen Laktation stark hochreguliert werden. Der erh√∂hte Carnitintransport k√∂nnte die Belastung durch Krankheiten, wie beispielsweise Ketose oder Fettleber vermindern, die bei Milchk√ľhen durch eine negative Energiebilanz und Entz√ľndungen hervorgerufen werden.
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