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Funktionelle Charakterisierung der pestiviralen Ribonuklease E rns

characterization of the pestiviral ribonuclease E rns

Hausmann, Yvonne


Originalveröffentlichung: (2003) Wettenberg : VVB Laufersweiler 2003
Zum Volltext im pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.062 KB)


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-10973
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1097/

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Pesivirus, E rns, Ribonuclease, Substratspezifit√§t, N-Glykosylierungsstellen,
Freie Schlagwörter (Englisch): pestivirus, E rns, ribonuclease, substrate-specificity, N-glycosylation sites
Universität Justus-Liebig-Universit√§t Gie√üen
Institut: Institut f√ľr Virologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-89687-618-x
Sprache: Deutsch
Tag der m√ľndlichen Pr√ľfung: 11.02.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 09.05.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Die T2 Ribonuklease Erns ist ein Glykoprotein, das ausschlie√ülich bei Pestiviren vorkommt. Es tritt sowohl als Strukturprotein als auch als sezerniertes Protein in Erscheinung. W√§hrend E rns f√ľr die Bildung von Viruspartikeln als essentiell beschrieben wurde, ist die Funktion der RNase f√ľr den viralen Lebenszyklus sowie die Pathogenese unbekannt.

Um die Enzymfunktion von Erns zu analysieren, wurden drei experimentelle Ansätze gewählt: 1. Bestimmung der Substratspezifität, 2. Mutationsanalyse des aktiven Zentrums inklusive Modellierung des Proteins und 3. Einfluss von N-Glykosylierung auf die Enzymaktivität.



zu 1
Die Spaltspezifit√§t von Erns wurde auf der Grundlage von heteropolymeren RNA-Substraten in limitierenden Verdauen ermittelt. RNA-Fragmente, die nach limitierenden Verdauen durch Erns gebildet wurden, entsprechen einer Spaltung 5¬ī von Uridin (NpU). F√ľr die Untersuchung der NpU Spaltstelle wurden einzelstr√§ngige RNA-Molek√ľle (45-56 nt) eingesetzt, die sich nur an der N-Position unterscheiden (N= A, C, G oder U). Kinetische Bestimmungen der NpU Spaltung durch E rns ergaben Affinit√§tskonstanten zwischen 105‚Äď250 nM sowie einen geringen Substratumsatz von weniger als einem Molek√ľl Substrat/ Molek√ľl Enzym s-1.



zu 2
Auf der Grundlage der Substratspezifit√§t wurde ein RNase-Test f√ľr die Aktivit√§tsbestimmung von Erns-Mutanten entwickelt. Neben insgesamt 14 Mutationen im Bereich des aktiven Zentrums, die im Wesentlichen die Zugeh√∂rigkeit zur T2 RNase Familie best√§tigten, wurden auch C-terminale Verk√ľrzungen untersucht. Nach Verk√ľrzung des C-Terminus um 87 Aminos√§uren blieb die RNase-Aktivit√§t des Erns erhalten. Dieses Ergebnis ist in Analogie zu einem Modell von Erns, das auf der Grundlage von RNase Rh erstellt wurde. Auch das Modell l√§sst die Eigenst√§ndigkeit einer RNase-Dom√§ne erkennen, die etwa die N-terminale H√§lfte des Proteins umfasst (aa 1-103).



zu 3
Die Anheftung von Zuckermolek√ľlen an die Asparaginreste der N-Glykosylierungsstellen wird durch die Substitution von Asn durch Gln verhindert. Nach Substitution einzelner bzw. mehrerer Asparagine wurden insgesamt 38 Erns-Mutanten erzeugt, und die Aktivit√§ten nach Expression in eukaryonten Zellen bestimmt. W√§hrend in Abwesenheit aller N-Glykosylierungsstellen keine RNase-Aktivit√§t mehr nachgewiesen wurde, ist das Vorkommen von zwei N-Glykosylierungsstellen, NGS 1 und 5, f√ľr den Erhalt der enzymatischen Aktivit√§t ausreichend. Die gleichen N-Glykosylierungsstellen sind auch f√ľr die Vermehrungsf√§higkeit von KSPV in revers genetischen Experimenten essentiell.
Kurzfassung auf Englisch: The T2 Ribonuclease Erns is a glycoprotein, which is only present in pestiviruses. Erns is a structural protein and it is also secreted from infected cells. While it is described that Erns is essential for the formation of viral particles, the function of the RNase-activity for the viral lifecycle or pathogenesis is unknown.

To analyze the enzymatic function of Erns, three different experimental approaches were chosen: 1st determination of the substrate specificity, 2nd mutagenesis-studies with respect to the active site including modeling of Erns and 3rd influence of N-glycosylation on enzyme activity.



1st
To detect the cleavage specificity of Erns a limited digest of heteropolymeric RNA-substrates was performed. Under suboptimal conditions Erns cleaves exclusivly phosphodiesterbonds 5¬ī of uridine bases (NpU). To analyze the NpU cleavage site, single stranded RNA molecules of 45-56 nts were synthesized. These substrates only differ in the base at the N-position (N= A, C, G oder U). Kinetic parameters of the NpU cleavage for all four substrates revealed Km values of 105‚Äď250 nM and a low turn over rate (less than one molecule substrate/ molecule enzyme s-1).



2nd
Based on the substrate specificity an RNase-assay was established, which allowed the precise determination of the RNase-activity of various Erns-mutants. The results of 14 mutants with single amino acid exchanges in the active center mainly conformed the integration of Erns into the family of T2 RNases. In addition Erns was C-terminal truncated and the Rnase-activity was measured. The deletion of 87 C-terminal amino acids still led to an active RNase. These results conformed a model of Erns, which was designed based on the crystal structure of the T2 RNase Rh. According to the 3-D structure the N-terminal half of the protein forms an independent RNase domain (aa 1-103).



3rd
Asn to Gln substitution abolishes the linkage of sugar molecules to the asparagine residue of N-glycosylation sites. Substitution of single, double or multiple asparagine residues resulted in 38 Erns-mutants. The Erns-mutants were expressed in eucaryotic cells and the RNase activity was analyzed. While the deletion of all N-glycosylation sites led to an inactive enzyme, a minimal set of two N-glycosylation sites, NGS 1 and 5, turned out to be sufficient for RNase activity. In a reverse genetic system the same minimal set was also essential for the detection of CSFV.
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