TY  - THES
T1  - Charakterisierung der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest
T3  - Giessen : VVB Laufersweiler
A1  - Lamp,Benjamin Jakob Joachim
Y1  - 2011/11/01
N2  - Die Biosynthese der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest
(KSPV) wurde hinsichtlich der Hierarchie und Dynamik der proteolytischen Reifung
charakterisiert. Dabei wurden ein wildtypisches nicht-zytopathogenes Feldvirus sowie
zwei zytopathogene Konstrukte untersucht, um einen Bezug zu beschriebenen Daten vom
nahe verwandten BVDV zu ermöglichen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Ein GST-NS2-3 Fusionsprotein, ein C-terminales Fragment der NS3-Helikase, ein
C-terminales Fragment von NS4B und das vollständige NS5A des KSPV wurden
in E. coli exprimiert und mittels Ni2+-Ionen Affinitätschromatographie gereinigt.
Nach Immunisierung von Versuchstieren erfolgte die Herstellung und
Charakterisierung monoklonale Antikörper (mAbs) gegen diese Proteine.
2. Indirekte Immunfluoreszenz-Analysen zeigten eine enge Assoziation aller KSPV
Nichtstrukturproteine mit den Membranen des endoplasmatischen Retikulums. In
Immunoblotanalysen eines zp KSPV Replikons und des nzp KSPV konnten die
Vorläufermoleküle NS4-5 und NS2-3, die Prozessierungsintermediate NS5A/B,
NS4B-5A und NS4A/B zusammen mit den reifen Nichtstrukturproteinen
identifiziert werden. Außerdem zeigte sich eine zusätzliche interne Prozessierung
des reifen NS3 zwischen der Protease- und Helikasedomäne des Moleküls.
3. In nzp KSPV, zp KSPV-JIV und dem zp KSPV Replikon wurde die Prozessierung
der Nichtstrukturproteine mittel Immunpräzipitation und „pulse chase“ Analysen
dargestellt. Während der zp Biotyp des KSPV eine effiziente Generierung aller
Nichtstrukturproteine zeigt, erfolgt die Reifung dieser Proteine im nzp Biotyp nur
sehr langsam. Zum Vergleich der Biotypen wurden die Halbwertszeiten der
Vorläufermoleküle und reifen Produkte bestimmt. In diesen Analysen erwiesen
sich die reifen Proteine des KSPV als stabil (T1/2: 1,5-4 h). Im zp Biotyp werden
die Vorläufermoleküle schneller umgesetzt (T1/2: 0,5-2,5 h) als die reifen
Nichtstrukturproteine abgebaut werden, so dass die reifen Proteine in den Zellen
akkumulieren. Dagegen erzeugt die langsame Reifung der Vorläufermoleküle im
nzp Biotyp (T1/2: 2,5-5,5 h) eine konstante Menge an reifen Nichtstrukturproteinen
in den infizierten Zellen. Diese Daten deuten erstmals darauf hin, dass die
gesteigerte Expression von NS3 im zp Biotyp eines Pestivirus die Prozessierung
der anderen Nichtstrukturproteine beschleunigt. Umgekehrt beschränkt die
verminderte NS2-3 Spaltung in nzp Pestiviren die Aktivität der NS3 Protease und
reguliert so die Konzentration der reifen Nichtstrukturproteine.
CY  - Gießen
PB  - Universitätsbibliothek
SN  - 978-3-8359-5822-7
AD  - Otto-Behaghel-Str. 8, 35394 Gießen
UR  - http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2011/8381
ER  -