TY - THES T1 - Isolierung und Analyse eines Bindungsglobulins für Herzglykoside aus Rinderblut A1 - Kost,Holger Y1 - 2001/10/28 N2 - Die pflanzlichen Herzglykoside Ouabain und Digoxin regulieren nach neueren Erkenntnissen in Säugetieren als Steroidhormone der Nebenniere den Salz- und Wasserhaushalt. Da Steroidhormone gebunden an spezifische Bindungsproteine im Blut transportiert werden, sollte ein neu nachgewiesenes Bindungsprotein für Herzglykoside aus Rinderblut gereinigt und weiter charakterisiert werden. Nach dem Nachweis des Herzglykosidbindungsproteins CGBG durch Affinitätsmarkierung mit dem proteinreaktiven Digoxigeninderivat N-hydroxysuccimidyl-Digoxigenin-3-o-methyl-aminocaproat (HDMA) gelang es spezifische Antikörper zu gewinnen. Damit konnte das Bindungsglobulin CGBG aus der Globulinfraktion des Rinderserums 900 000-fach gereinigt werden. Hierzu waren eine Vorreinigung des Proteins am Kationenaustauuscher CM-Sephadex, eine Affinitätschromatographie an einer spezifischen Antiköpersäule und eine Nachreinigung an der Anionenaustauschersäule Phenomenex Biosep DEAE erforderlich. Die Proteinausbeute der in 3 Tagen durchzuführenden Proteinreinigung betrug 0,0001%.
Das Herzglykosidbindungsprotein ist ein Glykoprotein von Mr 90 kDa in der SDS-PAGE. Der N-Terminus ist durch Pyroglutamat blockiert. Nach Deblockierung mit Pyroglutamase kann durch Edman Abbau die Sequenz ALPNVETSV bestimmt werden. Für sie und eine weitere mit Lys-C erhaltene Sequenz KDLESHYLFERH, sowie eine durch CNBr-Spaltung erhaltene Sequenz GKLFNIVNKXQQAL fanden sich in den SwissProt- und TrEMBL-Datenbanken keine Sequenzhomologien. Das Protein ist somit bisher unbekannt. Der Kohlenhydratanteil des CGBG enthält u.a. Neuraminsäuren, wie durch Interaktion mit verschiedenen Lektinen bestimmt werden konnte. Die N-glycosidisch am Protein gebundenen Kohlenhydrate tragen 10-15% zur Molmasse bei. Unterschiedliche Glykosylierungsmuster erklären die Heterogenität des IEP des nativen Proteins zwischen pH 4,4 und 5,6; denn nach Deglykosylierung ist der IEP 5.6. Mittels Molekularsiebchromatographie ergab sich für das native CGBG eine Molmasse von 820 kDa und unter denaturierende Bedingungen von 180 kDa. Es wird daraus geschlossen, daß das Herzglykosidbindungsprotein ein Pentadimer von 180 kDa ist, in dem die Monomere von 90 kDa durch Disulfidbrücken verknüpft sind.
Mittels Affinitätsmarkierung mit HDMA und mittels Tryptophanfluoreszenzlöschung wurden die spezifische Interaktion des gereinigten Proteins mit Herzglykosiden nachgewiesen. Es gelang 2 Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität von Kd1 = 2,4 nM und von Kd2 = 500 nM nachzuweisen. Das Protein interagiert nicht mit anderen Steroidhormonen.
Gegen das isolierte 90 kDa-Herzglykosidbindungsprotein konnten in Kaninchen spezifische polyklonale Antikörper erzeugt werden. Sie erkannten nur die 90 kDa Proteinbande in einer teilweise gereinigten Proteinfraktion. KW - Herzglykosid KW - Bindungsglobulin KW - Rinderblut KW - Rind CY - Gießen PB - Universitätsbibliothek AD - Otto-Behaghel-Str. 8, 35394 Gießen UR - http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2001/528 ER -