TY - THES T1 - Molekular- und zellbiologische Analyse des Invasionsmechanismus von Listeria monocytogenes in eukaryontische Zellkulturen A1 - Pashalidis,Philippos Benedikt Y1 - 2001/08/22 N2 - Der Krankheitserreger L. monocytogenes ist ein v.a. für Feten und immunsupprimierte Personen gefährliches Bakterium. Eine recht unspezifische Klinik und die Vermehrung des Keimes in Lebensmitteln unter anspruchslosen Bedingungen machen die durch L. monocytogenes ausgelöste Listeriose zu einer ernstzunehmenden Krankheit mit zahlreichen Manifestationsformen. Besonderes Interesse erlangt dieses Bakterium in zahlreichen Untersuchungen auch deswegen, weil es in der Lage ist, verschiedene Gewebe bzw. Barrieren des Körpers zu überwinden. Sowohl die Darmbarriere als auch die Blut-Hirn- und Plazentaschranke können überwunden werden, was u.a. zu den vielfältigen Manifestationsformen der Erkrankung führt. Die Erforschung der Invasionsstrategien von L. monocytogenes wird durch die Möglichkeiten von Infektionsmodellen (Maus, Zellkultur) und genetischen Veränderung der Bakterien (Transposon-Mutanten, Transformation mit Plasmid-DNA, Komplementation von Deletionsmutanten) unterstützt.
In dieser Arbeit wurde zunächst das offene Leseraster ORFA und das inlAB-Operon von L. monocytogenes EGD 1/2a sequenziert und mit der bekannten Sequenz von L. monocytogenes EGD-SmR (Gaillard et al., 1991) verglichen. Die Genprodukte des inlAB-Operons sind entscheidend am Invasionsmechanismus in eukaryontische Zellen beteiligt. Der Vergleich ergab eine sehr hohe Homologie und damit nahezu identische Nukleotidsequenzen. Somit konnte davon ausgegangen werden, daß der in dieser Arbeit verwendete Stamm EGD sehr ähnliche Voraussetzungen für die Invasion hat wie der in der Literatur beschriebene LO28. Die Auswirkung der genetischen Unterschiede und damit der Unterschiede in der Aminosäuresequenz auf die räumliche Struktur der Proteine muß mit Verfahren wie der Röntgen-Strukturanalyse weiter abgeklärt werden.
Die Komplementation der [Delta]inlAB2-Deletionsmutanten mit verschiedenen rekombinanten Plasmiden des Vektors pERL-3 und die Überprüfung der Stämme in Invasionsassays ergab unterschiedliche Abhängigkeiten von den Proteinen InlA und InlB je nach Zellinie. Diese Ergebnisse stützen daher den von Dramsi geprägten Begriff des 'Zelltropismus', mit dem die unterschiedlichen Abhängigkeiten beschrieben werden (Dramsi et al., 1995). Das Bakterium verfügt durch die Internaline und deren unterschiedliche Effekte in verschiedenen Zellinien über eine große Variabilität, die als Ausdruck der Variabilität in vivo gesehen werden kann.
Die Komplementation von L. innocua mit verschiedenen rekombinanten Plasmiden des Vektors pERL-3 und die durchgeführten Invasionsassays zeigten, daß der an sich nicht-invasive Stamm mit dieser Technik der genetischen Veränderung invasiv gemacht werden kann, wenn auch die Invasionsraten erheblich unter denen der [Delta]inlAB2-Komplementante lagen. Der Zelltropismus zeigte sich auch in diesen Untersuchungen, war aber nicht identisch mit den Ergebnissen der [Delta]inlAB2-Komplementanten.
Durch die Komplementation der Deletionsmutante [Delta]vgc2 mit rekombinanten Plasmiden des Vektors pLiga164 konnte die Rolle des Regulationsfaktors PrfA näher beleuchtet werden. PrfA ist in der Lage, auch über die Aktivierung des actA-Promotors die Expression von InlB und damit die Invasion gegenüber dem Wildtyp L. monocytogenes zu steigern. Da der Deletionsmutante [Delta]vgc2 alle bekannten Virulenzgene fehlen, bedeutete die starke Invasion nach Komplementation mit dem die Gene prfA, inlA und/oder inlB tragenden Vektor, daß die anderen Virulenzgene für den Invasionsprozeß dieser Mutante nicht von Bedeutung sein müssen.
Die Komplementation von L. innocua mit den verschiedenen Derivaten des Vektors pLiga164 ergab im Invasionsassay niedrigere Invasionszahlen als die Komplementation von [Delta]vgc2. Da auch [Delta]vgc2 wie L. innocua die bekannten Virulenzgene fehlen, muß ein oder müssen mehrere noch unbekannte Faktoren in L. monocytogenes zur effizienteren Invasion beitragen.
In dieser Arbeit konnte ferner gezeigt werden, daß das von S. Müller gereinigte Protein InlB biologisch aktiv ist. Dazu wurden verschiedene Listerien-Stämme mit dem Protein vorinkubiert, woraufhin das Protein an die Bakterien binden und Invasivität wiederherstellen oder steigern konnte. KW - Listeria monocytogenes KW - Invasionsmechanismus KW - eukaryontische Zellkultur CY - Gießen PB - Universitätsbibliothek AD - Otto-Behaghel-Str. 8, 35394 Gießen UR - http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2001/492 ER -