TY  - THES
T1  - Lipasen aus Speisepilzen für den Einsatz in der Käserei
A1  - Kreuter,Nadja
Y1  - 2019/01/16
N2  - Bestimmte Käsesorten, wie z.B. Provolone oder Feta, werden üblicherweise unter Verwendung von Lipasen aus der Zungenwurzel von Ziegen, Schafen oder Kälbern hergestellt, um deren charakteristisches Geschmacksprofil zu generieren. Aufgrund der wachsenden Bedeutung von koscher- bzw. halal-zertifizierten Produkten ist es interessant, Lipasen mit ähnlichen katalytischen Eigenschaften aus Speisepilzen (Basidiomyceten) zu gewinnen. Dafür waren ausschließlich Wildtyp-Stämme vorgesehen, um ein „natürliches“ und „gentechnikfreies“ Produkt zu gewinnen.
In einem Screening in Submerskultur wurden insgesamt 31 verschiedene Speisepilze auf die Sekretion geeigneter Lipasen getestet. Anhand von photometrischen Assays wurde das Esterase-/Lipase-Sekretionsprofil der Basidiomyceten substratspezifisch in Abhängikeit von der Acyl-Kettenlänge verschiedener p-Nitrophenylester quantitativ erfasst. Die Selektion vielversprechender Produktionsorganismen erfolgte durch den Vergleich mit dem Hydrolyseprofil der Ziegenzungengrundlipase (Handelsprodukt „opti-zym z10uc“). Anschließend erfolgte eine Optimierung der Kulturparameter durch Einsatz verschiedener Nährmedien. Des Weiteren wurde die Sekretion der extrazellulären Lipasen durch Zusatz geeigneter Induktoren wie Butterschmalz, Butter und Quarkfett gesteigert. 
In Kooperation mit dem Projektpartner optiferm GmbH wurden Applikationstests durchgeführt. Dazu wurden aus jeweils 10 bzw. 3 Liter Milch Käselaibe der Käsesorte Weichkäse vom Typ Feta unter Lipase-Zusatz erzeugt. Die Testkäse wurden für 30 Tage bei 10 bis 15 °C gereift und anschließend für weitere 12 Wochen bei 4 °C gelagert. Über den Reifungs- und Lagerungszeitraum hinweg wurden die generierten Käsespezialitäten jeweils im Vergleich zum Referenzprodukt Ziegenlipase sensorisch beurteilt. Begleitend erfolgt eine umfassende instrumentell-analytische Charakterisierung der durch die Lipasen freigesetzten Fettsäuren. Die produzierten Käse wurden mittels Festphasenmikroextraktion (SPME) in Kopplung mit der gaschromatographischen Analyse mit massenspektrometrischer Detektion auf die Anwesenheit von freien Fettsäuren hin untersucht.
Die Herstellung von Käselaiben erfolgte mit folgenden Basidiomyceten: Lentinus squarrosulus, Auricularia fuscosuccinea, Flammulina velutipes, Pleurotus citrinopileatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus flabellatus und Lycoperdon pyriforme, deren sekretierte Enzyme mittels unterschiedlicher Verfahren gereinigt und konzentriert wurden. Am erfolgreichsten in Bezug auf die sensorischen Eigenschaften und den Vergleich der freien Fettsäuren war die Umsetzung mittels F. velutipes und P. citrinopileatus nach Fällung mit Ammoniumsulfat und Konzentrierung mittels Vivaflow200. Die anderen Kandidaten erwiesen sich als weniger geeignet für den Einsatz in Käse.
Die Isolierung der Lipasen aus dem Kulturüberstand der Basidiomyceten F. velutipes und P. citrinopileatus erfolgte mittels Schaumfraktionierung, Ammoniumsulfatfällung und anschließender zweistufiger chromatographischer Reinigung mittels Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) an einer schwachen Ionenaustauscher- und einer Größenausschlusssäule.
Die gereinigten Enzympräparationen aus F. velutipes und P. citrinopileatus wurden anschließend biochemisch charakterisiert. Dies erfolgte mittels elektrophoretischer Methoden wie der isoelektrischen Foskussierung (IEF) und der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Des Weiteren wurden Zymogramme unter seminativen Bedingungen zur Visualisierung der Lipase-Aktivität angefertigt. Anhand der gereinigten Enzyme wurden Temperatur- und pH-Optima sowie die enzymkinetischen Parameter Km und vmax bestimmt.
Zur molekularbiologischen Charakterisierung wurden die gereinigten Enzyme mittels Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) ansequenziert. Parallel dazu erfolgte die Entnahme von Myzel jeweils zum Zeitpunkt maximaler spezifischer Enzymaktivität im Kulturüberstand. Das Myzel wurde anschließend zur RNA-Isolierung mittels RNeasy® Plant Mini Kit unter flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Es folgte die Erststrangsynthese mittels reverser Traskription der Gesamt-RNA in cDNA. Anhand der Peptiddaten wurden Primer abgeleitet, die zur Amplifizierung der für das jeweilige Zielenzym codierenden cDNA mittels Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt wurden. Das Zielenzym aus F. velutipes konnte mit insgesamt neun verschiedenen Primern aus der genomischen DNA sequenziert werden. Aufgrund der höheren Aktivität gegenüber Substraten mit kurzkettigen Acyl-Resten kann das Enzym funktionell den Carboxylesterasen zugeordnet werden.

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