TY  - THES
T1  - Klonierung und Expression des anti-VEGF-Moleküls RA-01 in vitro
A1  - Wagner Lima,Nina
Y1  - 2013/10/01
N2  - Neovaskuläre Erkrankungen der Netzhaut, wie die altersabhängige Makuladegeneration oder die diabetische Retinopathie,  nehmen in der zunehmend älter werdenden Bevölkerung rapide zu. Grundlage der neovaskulären Erkrankungen ist ein überschießen¬des Blutgefäßwachstum in die Retina ausgelöst durch eine gesteigerte Aktivität des vascular endothelial growth factor (VEGF). Die aktuelle Therapiemethode besteht in der monatlich zu wiederholenden intravitrealen Injektion von anti-VEGF Molekülen wie Bevacizumab oder Ranibizumab. Der Nachteil dieser Behandlung ist jedoch der invasive Charakter der intravitrealen Injektion sowie die hohe finanzielle Belastung für die Patienten und das Gesundheitssystem. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines Expressionssystems, mit dem das anti-VEGF F(ab)-Molekül Ranibizumab (RA-01) in eukaryotischen Zellen produziert werden kann.
Die DNA Sequenz beider Peptide des F(ab) Fragmentes wurden für eine Expression in eukaryotischen Zellen durch Basenmodifizierung, Anhängen einer sekretorischen Leadersequenz und der Generierung bestimmter Enzymschnittstellen optimiert. Zwischen die DNA Sequenzen wurde eine internal ribosomal entry site (IRES) kloniert, um eine gleichzeitig Expression beider Peptide zu gewährleisten. Die Plasmide wurden in HEK293, HELA und arpe19 Zellkulturen transfiziert und das exprimierte Protein im Überstand per Western blot detektiert. Ein Ranibizumab spezifischer ELISA wurde entwickelt, um die Konzentration von RA-01 im Überstand messen zu können. Die biologische Aktivität von 
RA-01 wurde in einem human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) planar migration assay nachgewiesen.
RA-01 konnte im Überstand von allen getesteten Zellkulturen nach Transfizierung detektiert werden. Aufgrund der höchsten Transfektionsrate wurden für die Produktion des Proteins für weitere biologische Messungen HEK293 Zellen transfiziert. Die Konzentration des Proteins konnte per ELISA gemessen werden (0,378µg/ml). Eine Konzentration von 37,8ng RA-01 konnte im HUVEC Migrationsassay die VEGF induzierte Migration um 50% hem¬men, ähnlich der Hemmungsaktivität von 100ng kommerziell erhältlichem Ranibizumab (Lucentis®).
In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich ein biologisch aktives anti-VEGF F(ab) Fragment in eukaryotischen Zellen in vitro hergestellt. Die Aktivität von RA-01 ist mindestens so hoch wie rekombinant in Bakterien hergestelltes, kommerziell erhältliches Ranibizumab. Somit kann zukünftig unter Nutzung vorhandener Transfer- und Regulationssysteme RA-01 in vivo in der Retina hergestellt werden. Diese neue Behandlungsmethode könnte zukünftig die regelmäßige intraokuläre Injektion von anti-VEGF Molekülen ersetzen und einen kosten-günstigeren und weniger invasiven Therapie der neovaskulären Erkrankungen der Netzhaut darstellen.

KW  - anti-VEGF
KW  - Makuladegeneration
KW  - Ranibizumab
CY  - Gießen
PB  - Universitätsbibliothek
AD  - Otto-Behaghel-Str. 8, 35394 Gießen
UR  - http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2013/10086
ER  -